ENDONUKLEASER: FUNKTIONER, TYPER OCH EXEMPEL - BIOLOGI - 2025

De endonukleaser är enzymer som skär de fosfodiesterbindningar belägna inom nukleotidkedjan. Endonukleasbegränsningsställen är mycket varierande. Vissa av dessa enzymer skär DNA (deoxiribonukleinsyra, vårt genetiska material) nästan var som helst, det vill säga de är ospecifika.

Däremot finns det en annan grupp av endonukleaser som är mycket specifika i regionen eller sekvensen som ska klyvas. Denna grupp av enzymer kallas restriktionsenzymer, och de är mycket användbara inom molekylärbiologi. I denna grupp har vi de välkända enzymerna Bam HI, Eco RI och Alu I.

Endonukleaser skär DNA internt.
Källa: pixabay.com

Till skillnad från endonukleaser finns det en annan typ av katalytiska proteiner - exonukleaser - som är ansvariga för att bryta fosfodiesterbindningarna i slutet av kedjan.

Begränsning av endonukleaser

Restriktionsendonukleaser eller restriktionsenzymer är katalytiska proteiner som ansvarar för klyvning av fosfodiesterbindningarna inuti DNA-kedjan i mycket specifika sekvenser.

Dessa enzymer kan köpas från flera bioteknikföretag och deras användning är nästan väsentlig inom nuvarande DNA-manipulationstekniker.

Restonstrationsendonukleaser namnges med hjälp av de första bokstäverna i det binomiska vetenskapliga namnet på organismen från vilken de kom, följt av stammen (detta är valfritt) och slutar med gruppen av restriktionsenzymer som de tillhör. Till exempel är BamHI och EcoRI mycket använda endonukleaser.

Området för DNA som enzymet känner igen kallas restriktionsstället och är unikt för varje endonukleas, även om flera enzymer kan sammanfalla vid restriktionsställena. Denna plats består vanligtvis av en kort palindrom sekvens med cirka 4 till 6 baspar i längd, såsom AGCT (för Alu I) och GAATTC för Eco RI.

Palindromiska sekvenser är sekvenser som, även om de läses i riktningen 5 'till 3' eller 3 'till 5', är identiska. Till exempel för fallet med Eco RI är den palindromiska sekvensen: GAATTC och CTTAAG.

Funktioner och tillämpningar av restriktionsendonukler

Lyckligtvis för molekylärbiologer har bakterier under utvecklingen utvecklat en serie restriktionsendonukleaser som internt fragmenterar genetiskt material.

I naturen har dessa enzymer utvecklats - antagligen - som ett bakterieskyddssystem mot invasionen av främmande DNA-molekyler, såsom de från fager.

För att skilja mellan nativt och främmande genetiskt material kan dessa restriktionsendonukleaser känna igen specifika nukleotidsekvenser. Således kan DNA som inte har denna sekvens störas inuti bakterierna.

Däremot, när endonukleaset känner igen restriktionsstället, binder det till DNA: t och skär det.

Biologer är intresserade av att studera det genetiska materialet i levande saker. Men DNA består av flera miljoner baspar i längd. Dessa molekyler är extremt långa och måste analyseras i små fragment.

För att uppnå detta mål integreras restriktionsendonukleaser i olika molekylärbiologiska protokoll. Till exempel kan en individuell gen fångas och replikeras för framtida analys. Denna process kallas "kloning" av en gen.

Restriktionsfragmentlängd polymorfism (RFLP)

Restriktionsfragmentlängdspolymorfismer hänvisar till mönstret för specifika nukleotidsekvenser i DNA som restriktionsendonukleaser kan identifiera och skär.

Tack vare enzymernas specificitet kännetecknas varje organism av ett specifikt skärmönster i DNA med ursprung i fragment med varierande längder.

Typer av restriktionsendonukleaser

Historiskt sett har restriktionsendonukleaser klassificerats i tre typer av enzymer, betecknade med romerska siffror. Nyligen har en fjärde typ av endonukleas beskrivits.

Typ I

Det viktigaste kännetecknet för typ I-endonukleaser är att de är proteiner som består av flera underenheter. Var och en av dessa fungerar som ett enda proteinkomplex och har vanligtvis två underenheter som kallas R, två M och en S.

S-delen är ansvarig för igenkänningen av restriktionsstället i DNA. R-underenheten är för sin del väsentlig för klyvning och M ansvarar för katalysering av metyleringsreaktionen.

Det finns fyra underkategorier av typ I-enzymer, kända med bokstäverna A, B, C och D, som är vanligt förekommande. Denna klassificering är baserad på genetisk komplement.

Typ I-enzymer var de första restriktionsendonukleaserna som upptäcktes och renades. Men de mest användbara inom molekylärbiologi är typ II, som kommer att beskrivas i nästa avsnitt.

Typ II

Endonukleaser av restriktion av typ II känner igen specifika DNA-sekvenser och klyvning i en konstant position nära en sekvens som producerar 5 'fosfater och 3' hydroxyler. De kräver vanligtvis magnesiumjoner (Mg ²⁺ ) som kofaktorer , men det finns några som har mycket mer specifika krav.

Strukturellt sett kan de visas som monomerer, dimerer eller till och med tetramerer. Rekombinant teknik använder endonukleaser av typ II och av denna anledning har mer än 3 500 enzymer karakteriserats.

Typ III

Dessa enzymatiska system består av två gener, kallade mod och res, som kodar för underenheterna som känner igen DNA och för modifieringar eller begränsningar. Båda underenheterna är nödvändiga för begränsning, en process som är helt beroende av ATP-hydrolys.

För att klyva DNA-molekylen måste enzymet interagera med två kopior av den icke-palindromiska igenkänningssekvensen och platserna måste vara i en omvänd orientering på substratet. Klyvning föregås av en DNA-translokation.

Typ IV

En ytterligare grupp har identifierats nyligen. Systemet består av två eller flera gener som kodar för proteiner som klyver endast modifierade DNA-sekvenser, antingen metylerade, hydroximetylerade eller hydrometylerade glukosyl.

Exempelvis känner igen enzymet EckKMcrBC två dinukleotider med den allmänna formen RmC; en purin följt av en metylerad cytosin, som kan separeras av flera baspar - från 40 till nästan 3000. Klyvningen sker cirka 30 baspar efter det ställe som enzymet känner igen.

Endonukleaser typ V

Endonukleaser av denna typ är också kända som "homing" endonukleaser. Dessa enzymer känner igen och skär mål DNA-sekvensen på unika platser i genomet från 14 till 40 bp.

Dessa enzymer kodas ofta i introner och deras funktion tros vara att främja horisontell överföring av skurna sekvenser. Efter skärning sker en brytningsreparation i den dubbla DNA-spiralen baserat på den komplementära sekvensen.

exempel

Endonukleas I från E. coli fungerar som ett försvarssystem mot fag och parasiter. Det är främst beläget mellan det cytoplasmiska membranet och cellväggen. Det producerar dubbelsträngade pauser i det främmande DNA med vilket det interagerar i det periplasmiska utrymmet.

CRISPR-Cas endonukleaser är enzymer som verkar på försvarsmekanismen för många typer av bakterier. Dessa identifierar och skär specifika DNA-sekvenser från invaderande organismer, som i allmänhet är virus.

Nyligen upptäckte forskare vid Massachusetts Institute of Technology (MIT) CRISPR-Cas12bm genomredigeringssystem med hög precision för modifiering av mänskliga celler.

referenser

1. Burrell, MM (red.). (1993). Enzymer av molekylärbiologi. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Typ I-restriktionsenzymer och deras släktingar. Nukleinsyraforskning, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). Medicinsk mikrobiologi + StudentConsult på spanska + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restonteringsendonukleaser vid analys och omstrukturering av DNA-molekyler. Årlig granskning av biokemi, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Endonukleaser av typ II-restriktion: struktur och mekanism. Cell- och molekylärlivsvetenskap, 62 (6), 685.