STANDARD AGAR BEAD: BEGRUNDELSE, BEREDNING OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den standardräkningsagar är ett fast, icke-selektivt odlingsmedium, utformad för kvantifiering av den aeroba mikrobiella belastningen som föreligger i prover av dricksvatten, avloppsvatten, mejeridrycker, bland andra livsmedel. Detta medium är också känt som PCA-agar, för dess förkortning på engelska Plate Count Agar. Det skapades 1953 av Buchbinder, Baris och Goldstein.

Det räknade agarmediet är sammansatt av jästextrakt, triptein, glukos, agar och destillerat vatten. Denna formulering innehåller grundläggande näringselement som gör det möjligt att utveckla den nuvarande aeroba mikrobiella belastningen, inte krävande.

Decimala utspädningar för att räkna CFU i standardagarantal. Källa: Quentin Geissmann

Eftersom mediet inte innehåller hämmare, kan bakterier växa utan några begränsningar, vilket gör det idealiskt för allmän koloniträkning. Emellertid kommer plackkvantifieringstekniken inte att detektera alla närvarande bakterier, utan endast de som kan växa under de miljöförhållanden som den utsäde standardräknaren agaren utsätts för.

I detta avseende försöker plattkvantifieringstekniken generellt bestämma mängden bakterier av den aeroba mesofila typen, det vill säga de som växer vid temperaturer mellan 25 och 40 ° C, med en optimal tillväxttemperatur på 37 ° C. .

Denna bakteriegrupp är mycket viktig eftersom de flesta av de patogena bakterierna för människan finns där.

Det bör noteras att det ibland kan vara intressant att kvantifiera mängden psykrofila bakterier som finns i maten. Dessa bakterier är de som växer vid låga temperaturer (<20 ° C) och ansvarar för att mat sönderfaller snabbare, även i kylskåp.

På samma sätt kan termofila bakterier, som utvecklas i ett intervall mellan 50 ° C och 80 ° C eller mer, vara viktiga i vissa typer av livsmedel såsom konserver.

Mikrobiell kvantifiering uttrycks i kolonibildande enheter (CFU) per gram eller milliliter prov.

Grund

Standardräknarmediet är utformat för att möjliggöra en framgångsrik tillväxt av icke-fastidösa aeroba bakterier, eftersom jästextraktet, triptein och glukos ger de näringsämnen som krävs för god mikrobiell tillväxt.

Å andra sidan har mediet en ljus färg och ett transparent utseende, varför det är idealiskt för visualisering av kolonier som utvecklats med den djupa såddmetoden (hälla i en tallrik).

Koloniträkning enligt Drigalski spatula ympningsmetod är också möjlig.

När den mikrobiella belastningen är hög måste decimalutspädningar göras för att kunna räkna CFU: erna.

Det bör noteras att detta medium rekommenderas av American Public Health Association (APHA) för antalet aeroba mesofiler.

Förberedelse

Väg 23,5 g av det dehydratiserade mediet och upplöst i en liter destillerat vatten. För att upplösas fullständigt bör blandningen upphettas genom att omröras ofta tills den kokar. Underföljande steg beror på såddtekniken som ska användas.

För hällplattstekniken

Distribuera genom att fördela 12 till 15 ml i provrören. Därefter steriliseras i en autoklav vid 121 ° C i 15 minuter. Låt stelna vertikalt i form av ett block. Förvara i kylskåp tills användning.

Smält kontakten när du ska använda den. När den är smält, förvara den i ett vattenbad vid 44-47 ° C medan proverna är beredda.

För ytsådd

Sterilisera mediet i en autoklav vid 121 ° C och fördela sedan 20 ml i sterila petriskålar. Låt stelna, vänd in och förvara i kylen tills den används.

Temperera plattor före användning. PH för mediet bör vara 7,0 ± 0,2.

Använda sig av

Standard Count Agar används i aerob mesophil räkningsteknik under mikrobiologisk analys av vatten och mat. Räkningen av de aeroba mesofilerna är nödvändig, eftersom det bestämmer den sanitära kvaliteten på provet som studeras.

Tillämpningen av denna teknik (med användning av detta medium) möjliggör makroskopisk visualisering av isolerade kolonier för deras kvantifiering.

Plåthällteknik (djupsåddning)

-Bearbeta

Tekniken består av följande:

1) Homogenisera provet för att återfördela de närvarande bakterierna.

2) En initial suspension görs i en steril flaska eller påse med respekt för förhållandet 10 g eller 10 ml prov i 90 ml utspädningsmedel ( ^10-1 ).

3) Från den initiala suspensionen görs de relevanta decimalutspädningarna beroende på typ av prov. Ex: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Utspädningar görs med peptonvatten eller fosfatbuffert.

För att göra detta, ta 1 ml av den initiala suspensionen och placera den i 9 ml utspädningsmedel, fortsätt utspädningarna vid behov, ta nu 1 ml av 10 ^-2- utspädningen och så vidare.

4) Ta 1 ml av varje utspädning och placera i tomma sterila petriskålar.

5) Lägg till varje platta 12 till 15 ml standardräknaragar som tidigare smälts och sedimenterades vid 44 - 47 ° C.

6) Vrid försiktigt plattorna för att fördela provet längs agaren jämnt och låt det stelna.

7) Invertera plattorna och inkubera vid 37 ° C i aerobios under 24 till 48 timmar.

8) I slutet av tiden undersöks plattorna och kolonierna räknas i utspädningen som tillåter det. De plattor som har mellan 30 och 300 CFU väljs för räkningen.

Räkning kan göras manuellt eller så kan du använda koloniträknare.

De tillåtna värdena per ml prov kan variera från ett land till ett annat beroende på reglerna enligt vilka de regleras.

- Beräkning av UFC

Den allmänna beräkningen görs med följande formel:

Formel för den allmänna beräkningen av kvantifieringen av CFU: er. Källa: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analys av livsmedel, officiell analysmetodik, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tillgänglig på: anmat.gov.ar

Uttryck resultaten med 1 eller 2 siffror och multipliceras med lämplig bas 10. Exempel: om resultatet är 16 545 avrundas det baserat på den tredje siffran till 17 000 och det kommer att uttryckas på följande sätt: 1,7 x 10 ⁴ . Om resultatet nu var 16 436, runda det till 16 000 och uttryck 1,6 x 10 ⁴ .

Ytsåddningsteknik

-Bearbeta

-Inokulärt med 0,1 ml av det direkta provet om det är flytande, initial suspension ^10-1 eller av påföljande utspädningar 10 ^-2 , 10 ^-3 etc, i mitten av en standardräknaragarplatta.

-Distribuera provet jämnt med en Drigalski-spatel eller en L-formad glasstav. Låt det vila i 10 minuter.

-Vänd plattorna och inkubera aerobt vid 37 ° C i 24 till 48 timmar.

- Fortsätt att räkna kolonierna, välj de plattor som ligger i området mellan 20 - 250 CFU.

- Beräkning av UFC

För beräkningen tillämpas utspädningsfaktorn, som är den omvända. Antalet är avrundat till 2 signifikanta siffror (avrundning enligt den tredje siffran) och uttryckt i basen 10. Om 224 CFU till exempel räknas i provet utan utspädning ( ^10-1 ) rapporteras 22 x 10 ¹ CFU , men om siffran var 225, 23 x 10 ¹ CFU rapporteras.

Om 199 CFU räknas i 10 ^-3- utspädningen kommer 20 x 10 ⁴ CFU att rapporteras, men om 153 CFU räknas i samma utspädning kommer 15 x 10 ⁴ CFU att rapporteras.

QA

Standardräkningskulturmediet kan utvärderas med användning av kända certifierade stammar, såsom: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ATCC 12228, Shigella flex.

Om odlingsmediet är under optimala förhållanden, förväntas tillfredsställande tillväxt i alla fall, med undantag för L. fermentum, som kan ha ett regelbundet utbyte.

För att utvärdera odlingsmediets sterilitet bör en eller två plattor av varje framställd sats (utan ympning) inkuberas vid 37 ° C i aerobios i 24 timmar. Efter denna tid bör ingen tillväxt eller färgförändring observeras i mediet.

begränsningar

-Smält inte agaren mer än en gång.

-Det förberedda mediet kan pågå i upp till 3 månader så länge det förvaras i kylskåp och skyddas mot ljus.

-Detta medium är inte lämpligt för krävande eller anaeroba mikroorganismer.

referenser

1. National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analys av livsmedel, officiell analysmetodik, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tillgänglig på: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA tallriksräger. 2009. Tillgänglig på: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) enligt APHA och ISO 4833. Finns på: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar tallrik. 2015. Finns på: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B och Velázquez O. 2009. Tekniker för mikrobiologisk analys av livsmedel. 2: a upplagan Fakulteten för kemi, UNAM. Mexico. Finns på: depa.fquim.unam