OXIDASTEST: SKÄL, PROCEDUR OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den oxidastest är en diagnostisk metod som visar närvaron av enzymkomplexet kallas cytokromoxidas c. Detta system inducerar transformationen av cytokrom reducerad till oxiderad, eftersom det fångar syre och detta i sin tur fungerar som den sista elektronacceptorn (H ⁺ ) i andningskedjan.

Termen oxidas är ett kort sätt att hänvisa till enzymet cytokromoxidas, även känt som indofenoloxidas. I forntiden antogs att enzymerna cytokromoxidas och indofenoloxidas var två olika enzymer, men idag är de kända för att vara desamma.

Positivt och negativt oxidasetest. Källa: Ingen maskinläsbar författare tillhandahålls. Alpha.prim ~ commonswiki antog (baserat på upphovsrättsanspråk).

För deras del är cytokromer hemoproteiner som innehåller järn och kompletterar cytokromoxidas-systemet. Cytokromer kan variera från art till art.

Det finns olika varianter av cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 och 0). Vissa bakterier kan producera endast en, men andra upp till två eller tre i taget. I detta avseende är närvaron av cytokrom a och a3 känd som cytokromoxidas c. Detta är den typ av cytokrom som oxidastestet upptäcker.

Släktena Neisseria och Pseudomonas innehåller cytokromoxidas c. Dessa släkter ger det positiva oxidastestet och hjälper till att skilja dem från Acinetobacter respektive Stenotrophomonas-släkten.

Det finns också andra släkter som är oxidas-positiva.

Grund

Egenskaper hos cytokromoxidas-systemet

Cytokromoxidas-c-systemet fungerar på följande sätt: oxidas-positiva mikroorganismer använder syre för att generera energi genom aerob andning. Detta system fungerar tack vare transporten av elektroner från givarsubstanser som NADH ⁺ till receptorsubstanser, i detta fall syre.

Detta resulterar i produktion av energi (ATP) och vatten eller väteperoxid, beroende på det cytokromoxidas-system som mikroorganismen har.

Det är därför de flesta av de oxidas-positiva bakterierna också är katalas-positiva, ett nödvändigt villkor för att eliminera den producerade väteperoxiden, eftersom detta ämne är giftigt för bakterierna.

Cytokromoxidas-c-systemet finns i vissa aeroba bakterier, vissa fakultativa anaerober, få mikroaerofila och inga strikta anaerober. Det senare är förståeligt, eftersom strikta anaerober inte kan leva i närvaro av syre, därför saknar de cytokromoxidas-systemet.

Testprincip

I detta test använder den ämnen som fungerar som konstgjorda elektronacceptorer och ersätter naturliga i elektrontransportkedjan.

I huvudsak används färgämnen såsom parafenylendiamin och indofenol, som fungerar som receptorsubstrat och artificiella elektrondonatorer.

Parafenylendiamin oxideras av cytokromoxidas-systemet. Färgämnet i sin reducerade form är färglöst, men i dess oxiderade form är det färgat.

Således framgår närvaron av cytokromoxidas c-systemet; eftersom en positiv reaktion kommer att generera en lavendel eller blå-lila färg beroende på det använda reagenset.

Å andra sidan, om det sista elektronmottagande ämnet i andningskedjan skiljer sig från syre, kommer oxidastestet att vara negativt (det finns ingen färgproduktion); detta är fallet med anaeroba mikroorganismer.

På samma sätt, om den cytokrom som används av mikroorganismen skiljer sig från cytokromoxidas c, kommer den också att ge det negativa testet.

Bearbeta

Det finns olika reagens och protokoll för oxidastestet, alla för samma ändamål.

Reagens

Kovacs reagens, Gordon och McLeod reagens, Nadi reagens, Carpenter, Suhrland och Morrison reagens, och användning av oxidaskivor.

-Kovacs oxidasreagens

Den består av 1% tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid.

Kovacs reagens framställs genom att lösa 1 g av ovannämnda substans i 50 ml destillerat vatten. Det värms upp subtilt tills det är helt upplöst. Överför till en bärnsten flaska med tillräcklig kapacitet och fyll på volymen till 100 ml med destillerat vatten. Vänta minst 15 minuter innan du använder den. Förvara i kylskåp skyddat från ljus.

Det är märkt Kovacs oxidasreagens, för att skilja det från Kovacs-reagenset som används för att avslöja indoltestet. Detta reagens är det mest känsliga, mindre giftiga men dyrare än resten av reagensen.

En positiv reaktion kommer att bevisas med detta reagens med kolonifärgsändringen till lavendel, som snabbt blir lila nästan svart. En negativ reaktion är uppenbar eftersom det inte sker någon färgförändring i kolonin eller att den får en lätt rosa färg. Mediet kan också bli mörkare, men det betyder inte en positiv reaktion.

Med detta reagens är reaktionstiden avgörande, en färgförändring som sker mellan 5 till 15 sekunder betraktas som en positiv reaktion.

-Gordon och McLeod-reagens

Den består av dimetyl-p-fenylendiamindihydroklorid, även känd som N-dimetyl-p-fenylendiamin eller p-aminodimetylanilin-monohydroklorid. Det framställs enligt beskrivningen för Kovacs oxidasreagens, och ersätter den involverade substansen.

Detta reagens är något mer stabilt än Kovacs oxidasreagens, även om alla reagens som innehåller p-fenylendiamin är instabila.

Denna reaktion är senare, den tolkas som positiv med utseendet på en blå-lila färg inom 10 till 30 minuter.

-Nadi reagens

Den består av 1% a-naftol i etylalkohol (95% etanol) och 1% aminodimetylanilin. Blandningen framställs i lika delar och använder absolut etylalkohol som ett utspädningsmedel tills det tillförs en tillräcklig mängd för 100 ml.

-Carpenter, Suhrland och Morrison reagens

Den består av 1% p-aminodimetylalaninoxalat. Förbered dig på samma sätt som beskrivits för Kovacs oxidasreagens och byt ut för motsvarande substans.

Med lösningen klar bereds testremsor enligt följande: 6-8 cm Whatman No. 1 filterpappersremsor impregneras med 1% dimetyl-p-fenylendiaminoxalatreagens.

De får torka utan kontakt med metall, förvara i skruvklädda burkar med torkmedel och förvara i kylen. Dessa remsor är stabila i upp till 6 månader.

Det är det mest stabila reagenset av alla de nämnda och kan ta upp till 6 månader i lösning. En annan pluspoäng är att det inte färgar mediet runt kolonin om det används direkt på plattan.

Utseendet på en röd färg tolkas som ett positivt test.

-Oxidasskivor

Det är kommersiella skivor som är impregnerade med reagens för oxidastest. Det finns flera kommersiella varumärken på marknaden.

Användningen är ganska praktisk eftersom det inte är nödvändigt att framställa färska reagens, vilket underlättar arbetet. Resultaten är tillförlitliga så länge skivorna är korrekt bevarade.

protokoll

Direktplattmetod, indirekt metod på papper och användning av skivor impregnerade med oxidasreagens.

-Direktkortmetod

2 eller 3 droppar av något av de ovannämnda reagensen tillsätts för detta ändamål direkt på den eller de kolonier som finns i en platta av odlingsmedium som inte innehåller glukos.

Förändringen eller inte av färg på kolonierna tolkas, inte av mediet. Den giltiga reaktionstiden beror på det använda reagenset.

-Indirekt metod på papper

Skär en bit filterpapper (Whatman nr 1) till en storlek på 6 cm ² och placera den i en tom petriskål.

Tillsätt 2 eller 3 droppar Kovacs oxidasreagens på papperet, ta en del av kolonin som ska studeras med ett platinahandtag eller träpetare och sprida det i en rak linje på det reagensimpregnerade papperet. Tolk inom 5 till 10 sekunder.

Med remsorna framställda med Carpenter, Suhrland och Morrison reagens sprids en koloni på den torra remsan. En enda remsa används för att testa flera stammar. Tolk på 10 sekunder.

-Diskar (m

Fukta de kommersiella skivorna subtilt med sterilt destillerat vatten och överlagra kolonin som ska studeras. Det rekommenderas att använda plattorna vid 35 ° C, om plattor vid rumstemperatur eller kylplattor används är reaktionen lite långsammare. Tolk färgförändringen mellan 10 till 20 sek.

Kolonier på blod eller chokladagar kan användas.

-Diskar (indirekt metod)

Fukta skivan som tidigare beskrivits. Lägg den i en tom petriskål. Ta en tillräcklig mängd av kolonin för att studera med ett platinahandtag eller träpetsticka och placera på disken. Tolk färgförändringen mellan 10 till 20 sek.

Använda sig av

Släktet Neisseria och Acinetobacter är ibland mycket liknande morfologiskt eftersom även om släktet Acinetobacter är en Gram-negativ stav kan den ibland ta en kockoidisk form och distribueras i par och simulera släktet Neisseria.

I detta fall är oxidastest verkligen användbart. Neisseria-släktet är positivt och Acinetobacter-negativt.

Släktet Moraxella liknar dock släktet Neisseria och båda ger en positiv reaktion; Därför måste kolhydratfermenteringstester alltid utföras för definitiv identifiering.

Å andra sidan är oxidastestet användbart för att differentiera en bakterie som tillhör Enterobacteriaceae-familjen (allt oxidasnegativt) från andra fermentatorer, såsom släktet Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidas-positivt).

Släktet Vibrio och Helicobacter är också oxidas-positiva.

QA

Använd kända stammar av Escherichia coli som en negativ kontroll och stammar av Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontroll.

begränsningar

-Reagensen måste användas nylagda, deras hållbarhetstid i lösning vid rumstemperatur är kort eftersom de är mycket instabila. De kan kylas mellan 5 dagar och 2 veckor.

-Reagensen är färglösa, om de ändrar färg måste de kasseras. Skadade skivor dyker upp eftersom de blir mörkare med tiden.

-En positiv reaktion med Kovacs oxidasreagens mellan 15-60 sek anses vara en försenad reaktion och efter 60 sekunder bör den betraktas som negativ.

-Haemophylus influenzae ger en negativ oxidasreaktion om något reagens med dimetyl-p-fenylendiamin används, men positivt om Kovacs oxidasreagens (tetrametyl-p-fenylendiamin) används.

-Medium som innehåller glukos stör testet och ger falska negativa effekter.

-Bordetella pertussis-stammar kan ge en falsk positiv reaktion om de kommer från mycket koncentrerade blodagarplattor.

-Användningen av metall (järn) handtag ger en falsk positiv reaktion.

rekommendationer

-Eftersom reagensen är mycket instabila och tenderar att självoxidera rekommenderas att frysa portioner på 1 till 2 ml och avlägsnas vid behov.

- Ett annat sätt att försena auto-oxidationen av reagenset är att tillsätta 0,1% askorbinsyra när reagensen framställs.

-Eftersom reagensen är instabila rekommenderas en veckokvalitetskontroll.

-Reagens som inte klarar kvalitetskontrolltestet bör inte användas.

referenser

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Redaktör Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidastest." Wikipedia, den fria encyklopedin. 15 jan 2018, 10:32 UTC. 3 april 2019, 14:03
4. Världshälsoorganisationen. Laboratoriehandbok för identifiering och testning av mottaglighet för antimikrobiella medel av bakteriella patogener av folkhälsans betydelse i utvecklingsvärlden. 2004. Finns på: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagensremsor för diagnos av oxidasaktivitet i bakterier. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.