DNA-SEKVENSERING: MAXAM-GILBERT, METOD OCH EXEMPEL - BIOLOGI - 2025

Den DNA-sekvensering (deoxiribonukleinsyra) är ett förfarande i molekylärbiologiska laboratorier som tillåter att veta ordningen av nukleotider i det genetiska materialet av intresse. Vidare kan sekvenseringen av RNA (ribonukleinsyra) också beskrivas.

Denna teknik har varit oumbärlig för utvecklingen av biologiska vetenskaper. Det är också tillämpligt på andra kunskapsområden - till exempel medicinsk diagnos och kriminaltekniska undersökningar.

Källa: pixabay.com

Tidigare ansågs sekvenseringen av en DNA-sträng som en långsam och dyr aktivitet, vilket möjliggjorde identifiering av endast ett fåtal baspar i oligonukleotiderna.

Idag, med alla framsteg inom vetenskapen, är DNA-sekvensering en rutinmässig operation i många laboratorier världen över tack vare bidraget från nästan 50 års forskning på detta område. När det gäller kedjelängd kan upp till miljoner baspar sekvenseras på mycket kort tid.

För att göra detta finns det dussintals tekniker som utvecklas som varierar i pris och precision. I den här artikeln kommer vi att beskriva både klassiska och moderna tekniker, var och en med dess fördelar och nackdelar.

Fram till nu möjliggör sekvenseringstekniker att få sekvensen av kompletta genom, från små prokaryoter och jästar till det mänskliga genomet.

DNA-struktur

För att förstå metoder och tekniker som används för DNA-sekvensering är det nödvändigt att känna till vissa viktiga aspekter av molekylens struktur och sammansättning.

DNA är en biomolekyl som finns i alla levande saker, från bakterier till stora vattenlevande djur. Organeller - som mitokondrier och kloroplaster - har en cirkulär DNA-molekyl i sig. Även i vissa virus är det genetiska materialet som finns DNA.

Strukturellt sett är DNA en samling av nukleotider. Var och en består av ett kolhydrat, en kvävehaltig bas (A, T, C eller G) och en fosfatgrupp. Målet med DNA-sekvensering är att avslöja i vilken ordning de fyra kvävebaserna finns i sekvensen.

Historia

I mitten av 1950-talet beskrev forskarna Watson och Crick strukturen för DNA med hjälp av kristolografiska tekniker. Ingen av dessa forskare hade dock kunnat hitta ett sätt att ta upp sekvensen.

Trots att det fanns vissa föregångare var den viktigaste händelsen skapandet av Sanger-metoden, 1977. Frederick Sanger, metodens far, var en brittisk biokemist, vinnare av två Nobelpriser för hans enorma bidrag till biologiska vetenskaper.

Denna teknik är också känd i litteraturen som "kedjetermination" eller dideoxynukleotider. Principerna för denna teknik och de som har utvecklats baserat på förbättring och innovation kommer att beskrivas nedan.

Sanger-metoden

Utvecklingen av Sanger-metoden representerade en avgörande händelse inom molekylärbiologi. Det involverar de grundläggande komponenterna i DNA-replikeringsprocessen som normalt inträffar i cellen, men lägger till en speciell komponent: dideoxynukleotider.

Huvudkomponenter i reaktionen

- DNA-polymeras: DNA-polymerasenzymet är en avgörande del av processen. Denna molekyl deltar i replikationen av DNA-strängen och dess roll är syntesen av den nya strängen, och parar trifosfatdeoxiribonukleotiderna med de komplementära.

Kom ihåg att i DNA parar tyminer (T) med adeniner (A) genom två vätebindningar, medan cytosin (C) gör det med guanin (G) genom tre bindningar.

- Nukleotider: Sanger-sekvensering involverar två typer av nukleotider, de fyra 2'-deoxynukleotiderna (förkortade dATP, dGTP, dCTP och dTTP) och de fyra dideoxynukleotiderna (ddATP, ddGTP, ddCTP och ddTTP).

Även om dideoxynukleotider liknar de monomerer som normalt införlivas i DNA, saknar de en -OH-grupp i sin struktur. Detta gör det omöjligt att lägga till en ny nukleotid i kedjan.

Därför, när en speciell nukleotid tillsätts - på ett helt slumpmässigt sätt - till kedjan som bildas, förlamas syntesen. I slutet av reaktionen finns således kedjor av olika storlekar, var och en där reaktionen stoppades vid en annan punkt.

Experimentellt bereds fyra tester. Var och en innehåller DNA som extraheras från det biologiska provet av intresse, de normala nukleotiderna och en av de fyra speciella nukleotidtyperna. Antingen är de speciella nukleotiderna markerade med någon typ av lysrörsmarkör (se automatiserad sekvensering nedan).

Läs resultaten

Det första steget är att separera var och en av de syntetiserade kedjorna beroende på deras storlek. Vissa kommer att vara längre än andra, beroende på var de speciella baserna har införlivats.

Det finns olika biokemiska tekniker som gör det möjligt att separera komponenterna i en blandning med användning av storlek som en diskriminerande egenskap. I Sangers metod separeras de olika kedjorna genom elektrofores. I de mer sofistikerade varianterna av tekniken används kapillärelektrofores.

Således reser de längre trådarna mindre än de kortare varianterna. Detta system går sedan igenom en läsare som känner igen markören som ingår i varje dideoxynukleotid. På detta sätt kan ordningen på sekvensen vara känd.

Denna "första generationens" teknik kan läsa DNA-fragment som inte är större än 1 kilobas. För närvarande används Sanger-metoden i olika laboratorier, vanligtvis i dess moderna varianter. Dessutom används det för att bekräfta de resultat som erhållits med de mest komplexa teknikerna - men mindre exakta.

Automatisk sekvensering

När sekvensering krävs i stor skala accelereras processen genom automatisering. Detta är en variation av Sanger-kedjeavslutningsmetoden, där primrarna är märkta med lysrörsprodukter för att skilja dem.

Därefter körs reaktionsprodukten i en elektrofores - allt på en enda bana. När varje fragment lämnar den slutliga delen av gelén identifieras den snabbt genom dess fluorescerande märkning, med ett fel som omger 1%.

De mest sofistikerade systemen har ett system på upp till 96 kapillarrör som hanteras av en dator kopplad till en robot. Det vill säga 96 DNA-prover kan testas samtidigt. Således automatiseras processen som involverar elektrofores och analys av resultaten.

På en dag kan dessa system följa upp till 550 000 baser. Under processen är mänskligt arbete onödigt, det tar bara cirka 15 minuter att starta metoden.

Maxam-Gilbert sekvensering

Samtidigt som Sanger publicerade sitt arbete lyckades två forskare vid namn Allan Maxan och Walter Gilbert utveckla en annan metod för att få DNA-sekvensen. Metoden fick popularitet vid den tiden, men fördrivs senare av förbättringen av Sangers metod.

Till skillnad från Sanger-metoden involverar inte Maxan och Gilbert-sekvensering (eller kemisk sekvensering, som det också är känt) hybridiseringsreaktioner. Metodiken består av märkning med reaktiva medel i ena änden, följt av en reningsprocess.

En av de negativa aspekterna av denna teknik ligger i dess enorma komplexitet och användningen av kemikalier som är farliga för användaren. Kemiska avbrott induceras genom applicering av DMS, myrsyra, hydrazin och hydrazin med salter.

Bearbeta

Protokollet börjar med märkningen vid 5'-änden av strängen med fosformarkören 32, sedan sker en kemisk modifiering av kvävebasen och den separeras. Slutligen inträffar klyvningen av den abasiska regionen.

Först förkortar du strängen du vill sekvensera till mindre segment. Detta steg utförs med restriktionsenzymer, vilket resulterar i utskjutande ändar.

Därefter utförs reaktionen med ett alkaliskt fosfatas, vars syfte är att eliminera fosfatgruppen. Således kan ett polynukleotidkinas användas för att utföra märkningen.

Kedjan denatureras (de två trådarna öppnas). Sedan appliceras kemikalierna. Dessa klyvningsreaktioner utförs på ett kontrollerat sätt och det är känt vilka typer av bindningar varje applicerad kemikalie bryter.

Läs resultaten

Liksom i Sanger-metoden involverar läsningen av resultaten separering efter storlek på kedjorna erhållna i ett elektroforessystem. System sammansatta av polyakrylamid möjliggör en mycket tillräcklig upplösning för att läsa gelén.

Masssekvensering

Den massiva sekvenseringen omfattar en serie nya metoder, förkortade NGS, från engelska “Next Generation Sequencing”.

Metoderna klassificerade som NGS kräver ett tidigare DNA-amplifieringssteg (de fungerar inte med en enda molekyl). Dessutom varierar de använda plattformarna mycket. Principerna för de mest populära metoderna kommer att beskrivas nedan:

Pyrosequencing

Det handlar om att övervaka frisläppandet av ett pyrofosfat, som inträffar varje gång en ny nukleotid läggs till DNA-strängen. Ett system med enzymer är kopplat, så att utsläpp av ljus (som kan detekteras av en kamera) sker varje gång en ny nukleotid införlivas.

Processen börjar med separat inkubation av varje kvävebas för att verifiera om det är ljusemission eller inte. Pyrosequencing kan läsa långa trådar, men felfrekvensen som hittas är hög.

Syntesekvensering

Detta involverar införlivandet av märkta nukleotider. Dessa fluorescerande komponenter tillsättes, tvättas och den införlivade nukleotiden noteras. Sedan avlägsnas nukleotidetiketten och syntesen av strängen kan fortsätta. I nästa steg kommer en märkt nukleotid också att införlivas, och de ovannämnda stegen upprepas.

En nackdel med denna teknik uppstår när lysrörsmarkörerna inte avlägsnas helt. Dessa utsläpp skapar bakgrundsfel, vilket resulterar i betydande fel.

Ligeringssekvensering

Denna teknik skiljer sig från de andra, eftersom den inte använder DNA-polymeras. I stället är det viktigaste enzymet för denna metod ligas. Här används fluorescerande märkta DNA-fragment, det är länkat av enzymet och det detekteras.

Det största problemet med denna teknik är den korta fragmentlängden den kan bearbeta.

Ion Torrent Sequencing

Denna teknik är baserad på mätningen av H ⁺ jonen som släpps varje gång en ny nukleotid införlivas. Principen är ganska lik pyrosquencing, men mycket billigare.

exempel

Sekvensering av det mänskliga genomet

Sekvensering av det mänskliga genomet har varit en av de mest lovande utmaningarna i biologin, liksom att vara en av de mest hyllade rivaliteterna i vetenskapens historia. För forskarna som deltog i projektet blev sekvensering av genomet faktiskt en tävling.

1990 startade han det som kallades "mänskligt genomprojekt", under ledning av den berömda forskaren, nobelprisvinnaren, James Watson. Efter ett år, 1991, tar Venter utmaningen att "slå" Watson och sekvensera genomet före honom. 1992, gick Watson i pension och kommandot togs av en annan forskare.

1995 meddelade Venter sin framgång i fullständig sekvensering av ett bakteriegenom med slumpmässig sekvenseringsmetod. På liknande sätt meddelade det motsatta laget ett år senare sekvensering av jästgenomet.

År 2000 avslutades examen. Båda företagen publicerade sina preliminära helgenomresultat i två av vetenskapens mest prestigefyllda tidskrifter: Natur och vetenskap.

Men forskare fortsatte att arbeta med att förbättra förslagen, och 2006 slutfördes sekvenserna av vissa mänskliga kromosomer.

Betydelse och applikationer

Att känna till nukleotidernas ordning på en så viktig molekyl som DNA är värdefullt för biologer och närstående yrkesverksamma. Denna kedja av polynukleotider innehåller all nödvändig information för utveckling och underhåll av alla livsformer.

Av dessa skäl är kunskap om denna sekvens avgörande för biologisk forskning. I grund och botten gör sekvensering det möjligt att mäta en av de viktigaste egenskaperna hos biologiska system och fastställa skillnader mellan dem.

Sekvensering används ofta av taxonomer och systematiker, eftersom vissa DNA-sekvenser gör det möjligt att fastställa kriterier för att dra slutsatsen om två organismer tillhör samma art eller inte, förutom att de kan föreslå hypoteser om de fylogenetiska förhållandena mellan dem.

Dessutom har DNA-sekvensering tillämpningar inom medicin och diagnostik. Till exempel finns det billiga och tillgängliga system som genom sekvensering gör det möjligt att bedöma tendensen att utveckla vissa sjukdomar (som cancer) med hjälp av så kallade single nucleotide polymorfisms (SNPs).

Utredningar av kriminell och kriminalteknisk typ har också berikats med sekvenseringstekniker, som kan användas som tillförlitliga bevis på att en viss person deltar i ett brott.

referenser

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvenssekvensen: sekvensbestämning av DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Nästa generations sekvenseringsrevolution och dess påverkan på genomik. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Vetenskapliga rivaliteter. Från Galileo till mänskligt genomprojekt. Redaktionsparaninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA-sekvensering med kedjeavslutande hämmare. Förfaranden från National Academy of Sciences, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Nästa generations sekvensering omvandlar dagens biologi. Naturmetoder, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (red.). (2014). Nästa generations sekvensering. Caister Academic Press.