DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLINDOL): EGENSKAPER, SKÄL, ANVÄNDNING - KEMI - 2025

Den DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindol) är ett färgämne av fluorescensegenskap tjänar som en markör, ofta används inom tekniken för fluorescensmikroskopi eller flödescytometri, bland andra. Fluorescensen som den avger är ljusblå, dess excitation inträffar mellan 455-461 nm (UV-ljus).

DAPI-färgämne kan passera genom cellmembranet hos döda celler med stor enkelhet. Det kan också färga kärnorna i levande celler, men i detta fall måste koncentrationen av detta vara högre.

Kemisk struktur för det fluorescerande färgämnet DAPI. Källa: Bild: File: DAPI.svg är en vektorversion av den här filen. Det bör användas i stället för denna rasterbild när den inte är underlägsen / Richard Wheeler (Zephyris) Redigerad bild

Färgämnet har tillgång till cellulärt DNA för vilket det har en speciell affinitet, som binder med stor aviditet till kvävebaserna adenin och tymin. Av denna anledning är det mycket användbart i vissa molekylärbiologiska tekniker.

Denna förening tillhör gruppen av indolfärgämnen och har visat sig ha större känslighet för DNA än etidiumbromid och propidiumjodid, särskilt på agarosgeler.

Användningen av detta fluorescerande färgämne är mycket brett, eftersom det är användbart för: studera förändringar i DNA i apoptotiska processer (celldöd) och därför detektera celler i denna process; för DNA-fotavtrycksfoto (DNA-fotoutskrift); att studera bakteriell kontaminering; eller för att visualisera kärnkraftssegmentering.

Det har också använts i studien av kromosomala band, för detektering av Mycoplasmas sp DNA, i DNA-proteininteraktion, vid färgning och räkning av celler genom immunofluorescens och till och med för att färga mogna pollenkorn.

egenskaper

DAPI är förkortningen för dess kemiska namn (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Dess molekylformel är C ₁₆ H ₁₅ N _5. Den har en molekylvikt av 350,3. Nära UV-ljusområdet (345 till 358 nm) sker den maximala excitationen av DAPI-DNA-komplexet, medan den maximala fluorescensemissionen sker mellan 455-461 nm.

Detta färgämne kännetecknas som ett gult pulver, men strukturerna markerade med denna fluorofor avger ett strålande blått ljus.

Det är en förening löslig i vatten, men för att påskynda dess upplösning kan viss värme appliceras. Det kan spädas med PBS men inte direkt upplösas i det.

När färgämnet har berettts måste det förvaras i mörkret, det vill säga skyddat mot ljus, vid en temperatur av 2 till 8 ° C (kylskåp). Under dessa förhållanden är färgämnet stabilt i mer än 3 veckor eller månader.

Om den är skyddad från ljus men lämnas vid rumstemperatur sjunker stabiliteten till 2 eller 3 veckor, men utsätts för direkt ljus är försämringen mycket snabb. Om du vill lagra mycket längre kan det kylas vid -20 ° C fördelat i alikvoter.

Grund

Denna färgning är baserad på att generera en kärnvidd i huvudmolekylärbiologiteknikerna, såsom flödescytometri, fluorescensmikroskopi och färgning av metafaskromosomer eller mellanfaskärnor, bland andra.

Denna teknik är baserad på den stora affiniteten som färgämnet har för kvävebaserna (adenin och tymin) som finns i det genetiska materialet (DNA) i det mindre spåret. Även på cytoplasmatisk nivå lämnar det mycket liten bakgrund.

När det fluorescerande färgämnet binder till adenin- och tyminregionerna i DNA ökar fluorescensen signifikant (20 gånger mer). Färgen som den avger är ljusblå. Det är anmärkningsvärt att det inte finns någon fluorescensemission vid bindning till GC (guanin-cytosin) baspar.

Det är viktigt att notera att även om det också har en affinitet för RNA orsakar detta inte problem, eftersom den högsta graden av energiutsläpp från denna molekyl sker vid en annan våglängd (500 nm), till skillnad från DNA, vilket gör det vid 460 nm. Vidare är ökningen av fluorescens när den är bunden till RNA endast 20%.

DAPI används mer för att färga döda (fasta) celler än levande celler, eftersom en mycket högre koncentration av färgämnet behövs för att färga de senare, beror detta på att cellmembranet är mycket mindre permeabelt för DAPI när det är levande.

DAPI-färgämne kan användas i kombination med röda och gröna fluoroforer för en mångfärgad upplevelse.

Använda sig av

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) är en utmärkt fluorofor och används därför ofta i olika tekniker och för olika ändamål. Följande förklarar användningen av DAPI i huvudteknikerna.

Flödescytometri

Forskarna Gohde, Schumann och Zante 1978 var de första som använde och föreslog DAPI som en fluorofor i flödescytometri-tekniken, med stor framgång på grund av dess höga känslighet för DNA och dess höga intensitet i fluorescensemission.

Användningen av DAPI i denna teknik möjliggör studier av cellcykeln, kvantifiering av celler och färgning av levande och döda celler.

Även om det finns andra färgämnen, såsom etidiumbromid, Hoechstoxid, akridinorange och propidiumjodid, är DAPI en av de mest använda eftersom den är mer fotostabil än de som tidigare nämnts.

För denna teknik krävs det att fixera cellerna, för detta kan absolut etanol eller 4% paraformaldehyd användas. Provet centrifugeras och supernatanten kastas, därefter hydreras cellerna genom tillsats av 5 ml PBS-buffert under 15 minuter.

Medan tiden går förbereder du DAPI-fläcken med en färgningsbuffert (FOXP3 från BioLegend) i en koncentration av 3 uM.

Centrifugera provet, kasta supernatanten och täck sedan med 1 ml DAPI-lösning i 15 minuter vid rumstemperatur.

Ta provet till flödescytometern med lämplig laser.

Flödesmikrofluorometri

En annan teknik där DAPI används är i flödesmikrofluorometri tillsammans med en annan fluorofor som kallas mithramycin. Båda är användbara för att kvantifiera kloroplast-DNA individuellt, men DAPI är bäst lämpad för att mäta T4-bakteriofagpartiklar.

hybridisering

Denna teknik använder i princip DNA-prover märkta med ett fluorescerande färgämne som kan vara DAPI.

Provet kräver värmebehandling för att denaturera det dubbelsträngade DNA och omvandla det till två enkelsträngade strängar. Därefter hybridiseras med en DAPI-märkt denaturerad DNA-sond som har en sekvens av intresse.

Senare tvättas det för att eliminera det som inte hybridiserades, en kontrast används för att visualisera DNA: t. Fluorescensmikroskopet tillåter observation av den hybridiserade sonden.

Denna teknik har syftet att detektera specifika sekvenser i kromosomalt DNA och kunna ställa diagnos av vissa sjukdomar.

Dessa cytomolekylära tekniker har varit till stor hjälp för att bestämma detaljer i studien av karyotyper. Till exempel har han visat de basparrika regionerna i adenosin och timmin som heter heterokromatiska regioner eller DAPI-band.

Denna teknik används allmänt för att studera kromosomer och kromatin i växter och djur, såväl som för diagnos av prenatala och hematologiska patologier hos människor.

I denna teknik är den rekommenderade DAPI-koncentrationen 150 ng / ml under en tid av 15 minuter.

Monterade objektglas ska förvaras skyddade mot ljus vid 2-8 ° C.

Immunofluorescensfärgning

Celler fixeras med 4% paraformaldehyd. Om andra fläckar ska användas lämnas DAPI i slutet som en försänkning och cellerna täcks med PBS-lösning under 15 minuter. Medan tiden går förbereder du DAPI-lösningen genom att spädas ut med PBS, så att den slutliga koncentrationen är 300 | im.

Därefter avlägsnas överskottet av PBS och täcks med DAPI i 5 minuter. Tvättar flera gånger. Sliden visas under ett fluorescensmikroskop under lämpligt filter.

Säkerhetsblad

Denna förening måste hanteras med försiktighet, eftersom det är en förening som har mutagena egenskaper. Aktivt kol används för att eliminera denna förening från vattenhaltiga lösningar som ska kasseras.

Handskar, klänning och skyddsglasögon måste användas för att undvika olyckor med detta reagens. Om kontakt med huden eller slemhinnan uppstår bör området tvättas med tillräckligt med vatten.

Du bör aldrig pipettera detta reagens via munnen, använd pipetter.

Förorena inte reagenset med mikrobiella medel eftersom det kommer att leda till felaktiga resultat.

Späd inte ut DAPI-fläcken mer än rekommenderat, eftersom detta avsevärt minskar kvaliteten på fläcken.

Utsätt inte reagenset för direkt ljus, eller håll det varmt eftersom det minskar fluorescensen.

referenser

1. Brammer S, Toniazzo C och Poersch L. Corantes vanligtvis involverade i växtcytogenetik. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tillgänglig från: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Finns på: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocelllaboratorier. 2019. Instruktioner för användning av DAPI. tillgängligt på cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Begrepp och tekniker inom floden ekologi. (2009). Redaktionella rubiner, Spanien. Finns på: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Användning av fluorescens i en modifierad dissektormetod för att uppskatta antalet myocyter i hjärtvävnad. Arch Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tillgängligt från: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Närvaro av fytoplasmas i papaya (Carica papaya) i Mexiko. Chapingo Magazine. Horticulture-serien, 2011; 17 (1), 47-50. Finns på: scielo.org.