LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: FOUNDATION, FÖRBEREDELSE OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den Löwenstein-Jensen -medium är ett selektivt fast medium för isolering och utveckling av bakterier av släktet Mycobacterium, såsom Mycobacterium tuberculosis, M. avium, bland andra, med undantag av de leprae art, som inte är odlingsbara.

Bakterier av släktet Mycobacterium växer inte i konventionella odlingsmedier, därför var det nödvändigt att utforma ett speciellt medium för deras isolering. Det ursprungliga mediet skapades av Löwenstein och senare modifierades av Jensen.

Löwenstein-Jensen medium med kolonier av Mycobacterium tuberculosis. Källa: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., med tillstånd av Biologi Image Library

Modifieringen bestod i eliminering av Kongo röda färgämne, och ersatte det med en högre koncentration av malakitgrönt. Det förändrade också koncentrationerna av magnesiumcitrat och monopotassiumfosfat.

Löwenstein-Jensen-medium innehåller för närvarande potatisstärkelse, asparagin, magnesiumcitrat, monopotassiumfosfat, magnesiumsulfat, malakitgrön, nalidixinsyra, cykloheximid, lincomycin, slagna ägg, glycerin och vatten.

Mykobakterier isoleras normalt från platser som inte är sterila, såsom sputum, urin, abscesser, bland andra. Detta innebär att de flesta av proverna kommer att innehålla den vanliga mikrobiota i området, plus patogenen.

Det är därför Löwenstein-Jensen-mediet innehåller en serie hämmare i sin sammansättning representerad av malakitgrön, antibiotika och svampdämpande medel.

Dessutom måste prover som kommer från icke-sterila platser dekontamineras och neutraliseras innan de utsädes i Löwenstein-Jensen-mediet.

Grund

Närvaron av ägg och glycerin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerar tillväxten av mykobakterier eftersom de ger de fettsyror och proteiner som är nödvändiga för utvecklingen av dessa mikroorganismer.

Löwenstein-Jensen-medium innehåller malakitgrönt, vilket är en hämmare av den åtföljande mikrobiota. Men den innehåller också nalidixinsyra (35 μg / ml), som hämmar den Gram-negativa mikrobiota, cykloheximid (400 μg / ml), som hämmar saprofytiska svampar och jästar, och lincomycin (2 μ / ml), som hämmar den Gram-positiva mikrobiota.

Vissa kommersiella företag föredrar att lägga till följande kombination av antibiotika: polymyxin B 200 000 enheter / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicillin 50 mg / L och trimetoprim 10 mg / L.

Detta medium innehåller inte agar, därför stelnar mediet på grund av koaguleringen av albuminet som finns i ägget under sterilisering.

Förberedelse

Väg 37,3 g av det dehydratiserade mediet i 600 ml destillerat vatten till vilket 12 ml glycerol tidigare har tillsatts. Blandningen upphettas, omrörs ofta tills den är helt upplöst. Autoklavera mediet vid 121 ° C i 15 minuter.

Å andra sidan bör en homogen suspension av 1000 ml färska ägg framställas under aseptiska förhållanden. Tillsätt äggsuspensionen till 600 ml medium framställd vid en temperatur av 50 - 60 ° C och undvik luftbubblor.

Antibiotiska lösningar tillsättes också efter sterilisering i autoklaven.

Häll mediet i sterila skruvklädda provrör. Värm rören vid 85 ° C i 45 minuter i ett lutande läge.

Färgen på det beredda mediet är akvamaringrönt och kan ge vitaktiga fläckar på grund av närvaron av ägglipider.

PH för mediet måste vara 7,2 ± 0,2

Förvara rör i kylskåp och skyddas från direkt ljus tills de används. Temperera före sådd.

Det finns en modifiering av mediet som kallas "Gruft modification of the Löwenstein Jensen". Detta innehåller samma föreningar som det klassiska mediet men RNA-5 mg / 100 ml tillsätts, och som hämmare innehåller malakitgrön 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml och nalidixinsyra 35 ug / ml.

tillämpningar

Löwenstein-Jensen-medium används för isolering av mykobakterier från olika typer av prover. En Ziehl-Neelsen-fläck rekommenderas för alla prov där det finns misstänkta närvaron av mykobakterier.

Vissa prover kommer från sterila platser men andra inte. Icke-sterila prover måste dekontamineras vid behov:

sputum

Sputumprover ska dekontamineras enligt följande: bestäm mängden sputumprov i ml och tillsätt samma mängd 4% NaOH till provet och inkubera vid 37 ° C.

Skaka blandningen ofta inom 30 minuter. Därefter centrifugeras vid 3000 varv / minut under 30 minuter.

Kasta supernatanten över en fenolisk desinfektionslösning. Använd sedimentet för sådd, men först måste pH neutraliseras.

Att neutralisera sedimentet, 5% H ₂ SO ₄ används i närvaro av den fenolrött indikator tills den når ett neutralt pH, som föranleder en lax färg.

Magsköljning, bronkialsköljning och bronkialaspirat

I detta fall måste provet centrifugeras vid 3000 varv / minut under 30 minuter. Supernatanten kastas och pelleten används. För att sanera sedimentet, tillsätt 3 ml 4% NaOH och rör om ofta vid 37 ° C under en halvtimme.

Centrifugera igen, supernatanten kasseras och pelleten används. Det senare måste neutraliseras såsom förklaras i sputumprovet.

Urin

Låt provet sätta sig i kylskåpet i 24 timmar. Separera supernatanten. Den återstående pelleten bör centrifugeras i 30 minuter vid 3000 RMP. Kasta supernatanten igen och rekonstituera pelleten med 3 ml steril fysiologisk lösning.

Tillsätt 3 ml 4% NaOH och fortsätt med sanering och neutralisering som beskrivits tidigare.

Ascites vätska, pleural vätska, cerebrospinal vätska

I denna typ av prov centrifugeras det och supernatanten kastas. Utför en Gram på sedimentet eller observera direkt under mikroskopet; Om bakterier inte observeras är saneringssteget inte nödvändigt och inte heller neutraliseringssteget.

I detta fall kan provet ympas direkt med sedimentet. Om det finns bakterier, fortsätt med att dekontaminera och neutralisera enligt ovan.

biopsier

Till denna typ av prov måste 5 ml destillerat vatten sättas till senare centrifug vid 1500 varv / minut under 10 minuter. Kasta supernatanten och centrifugera pelleten på nytt vid 3500 varv / minut under 30 minuter. Använd sedimentet för att så odlingsmediet.

Laryngeal pinne

Elpinnen ska placeras i ett sterilt rör som innehåller lika delar destillerat vatten och 4% NaOH. Vattpinnen måste pressas mot rörets väggar så att provet späds ut i vätskan. Centrifugera och använd sedimentet. Neutralisera sedimentet som redan beskrivits.

sås

Löwenstein-Jensen-mediet ympas genom att tillsätta 0,5 ml av provet på ytan av mediet. Vrid röret för att fördela provet genom mediet. Använd inte platinahandtag.

Ett andra rör som innehåller Stonebrink-medium kan ympas för att isolera Mycobacterium bovis och andra arter som inte växer på Löwenstein-Jensen-mediet.

Inkubation

De ympade rören inkuberas aerobt vid 37 ° C, med locket något löst och lutande vid ungefär 5 ° och skyddat från ljus. Miljön kan berikas med 5–10% koldioxid. Kontrollera kulturer två gånger i veckan tills kolonierna dyker upp.

När provet har absorberats dras locken åt. Den maximala inkubationstiden är 8 veckor, om det efter denna tid inte finns någon tillväxt, rapporteras den som negativ.

QA

Följande stammar kan användas som kvalitetskontroll:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, StreptococcusCocofcoc15coc15coc15coc155

Utmärkt utveckling förväntas för de första tre nämnda arterna, för M. fortuitum bör tillväxten vara bra, medan för M. bovis liten eller ingen tillväxt förväntas. Under tiden måste andra arter än släkten Mycobacterium hämmas fullständigt.

begränsningar

Det beredda mediet måste skyddas mot ljus, långvarig exponering för ljus får mediet att bli grönt till blått, i detta fall kan mediet inte längre användas. Detta beror på att malakitgrönt är ljuskänsligt.

Mediet, eftersom det innehåller ägg, kan lätt förorenas om det inte hanteras aseptiskt. Det kan lösas om det förorenas med proteolytiska bakterier.

Odling och manipulation av bakterier av släktet Mycobacterium kräver kvalificerad personal som är medvetna om de biosäkerhetsåtgärder som måste följas för att undvika att förorenas eller förorenas av andra.

HCl ska inte användas i neutraliseringssteget på grund av bildandet av natriumklorid, vilket kan vara giftigt för Kochs bacillus.

Proverna ska förvaras i kyla och skyddas mot ljus medan de inte behandlas.

Referens

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen selektivt medium. Finns på: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Finns på: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Finns på: foodafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen medium." Wikipedia, den fria encyklopedin. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24 april 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Redaktör Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokemiska tester för identifiering av bakterier av klinisk betydelse. 3: e upplagan Redaktionell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.