REKOMBINANT DNA: TEKNIK, TILLÄMPNINGAR OCH GRUNDLÄGGANDE - BIOLOGI - 2025

Det rekombinanta DNA (rDNA eller rDNA) är en konstgjord nukleinsyramolekyl som skapas i laboratoriet genom att integrera två segment av intresseorganisationer. Det är också känt som kimärt DNA, tack vare dess hybridegenskap. Denna typ av DNA finns inte i naturen.

Den grundläggande metoden för att generera den inkluderar: (a) valet av ett mål-DNA och dess införande i ett annat DNA-fragment (vanligtvis en bakterieplasmid); (b) införandet av denna plasmid i en bakterie, (c) urvalet av bakterierna med hjälp av antibiotika och slutligen (d) uttrycket av genen.

Källa: pixabay.com

Tekniken drar nytta av en uppsättning enzymer som gör det möjligt att kopiera och klistra in specifika DNA-fragment enligt forskarens bedömning.

Målet med rekombinant teknik är i de flesta fall uttrycket av ett protein (känt som rekombinant protein) som önskas av molekylärbiologen för framtida forskning eller att skapa ett protein med kommersiellt och terapeutiskt värde - såsom humant insulin, till exempel.

Grunderna för den rekombinanta DNA-tekniken och dess användning i genteknik

Molekylärbiologiens centrala dogma

Alla organiska varelser som vi känner delar flera egenskaper. En av dem är arten av det genetiska materialet och hur proteiner tillverkas - en process som kallas den centrala "dogmen" i molekylärbiologi.

Med undantag för ett par virus lagrar alla organismer genetisk information i DNA (deoxiribonukleinsyra), samlade på ett mycket kompakt och organiserat sätt i cellens kärna.

För genuttryck transkriberas DNA-molekylen till messenger-RNA, och den senare översätts till språket för aminosyror, byggstenarna för proteiner.

Vad är ett rekombinant DNA?

Mellan 1970- och 1980-talet började molekylärbiologer dra nytta av de processer som naturligt inträffar inuti cellen och kunde extrapolera dem till laboratoriet.

På detta sätt kan en gen av animaliskt ursprung (till exempel ett ryggradsdjur) införas i ett DNA-segment från en bakterie; eller DNA av en bakterie kan kombineras med ett viralt DNA. Således kan vi definiera ett rekombinant DNA som en molekyl som består av DNA från två olika organismer.

När denna hybrid eller rekombinant molekyl har skapats uttrycks genen av intresse. Med orduttrycket vill vi hänvisa till processen med översättning till protein.

Restriktionsenzymer och ligaser: nyckeln till processen

Ett viktigt element i utvecklingen av rekombinant DNA-teknik var upptäckten av restriktionsenzymer.

Dessa är proteinmolekyler som uppvisar förmågan att klyva DNA (nukleaser) i specifika sekvenser, som tjänar som "molekylsax". Fragmenten som genereras av dessa enzymer kallas restriktionsfragment.

Nämnda enzymer kan producera symmetriska snitt i målsekvensen (i båda kedjorna i samma höjd) eller asymmetriska snitt. En viktig aspekt av verkan av restriktionsenzymer är att efter klyvningen av kedjorna erhålls en "lös kant", komplementär till den andra kanten som skuras av samma enzym.

Några exempel är ECOR 1 och Sma 1. För närvarande är mer än 200 typer av restriktionsenzymer kända och kommersiellt tillgängliga.

För att vara användbar måste en sax åtföljas av limet. Denna förseglingsverkan av DNA (som tidigare behandlats med restriktionsenzymer) utförs av ligaser.

Teknik: hur modifieras en organisms DNA artificiellt i laboratoriet?

Nedan kommer vi att beskriva de viktigaste stegen som rekombinant DNA-teknik kräver. Alla utförs av proffs i ett molekylärbiologilaboratorium.

Vad är en "klon"?

Innan vi fortsätter med det experimentella protokollet måste vi notera att i molekylärbiologi och bioteknik används uttrycket "klon" och verbet "klon" i stor utsträckning. Detta kan leda till förvirring.

I detta sammanhang hänvisar vi inte till kloning av en hel organisme (som till exempel för det berömda fåret Dolly), utan till kloning av en bit DNA, som kan vara en gen. Det vill säga att producera många kopior - genetiskt identiska - av sekvensen.

1. Isolering och erhållande av DNA

Det första steget är att bestämma vilken sekvens du vill använda. Detta beror helt på forskaren och syftet med hans arbete. Detta DNA måste sedan isoleras och renas. Metoderna och procedurerna för att uppnå detta beror i sin tur på kroppen och vävnaden.

I allmänhet tas en vävnad och utsätts för behandling i en lysbuffert med proteinas K (ett proteolytiskt enzym) och därefter extraheras DNA: t. Därefter fragmenteras det genetiska materialet i små fragment.

2. Kloningsvektor

Efter de förberedande stegen försöker forskaren att införa DNA-segmentet av intresse i en kloningsvektor. Från och med nu kommer vi att kalla detta segment av vitt DNA för DNA.

plasmider

En av de mest använda vektorerna i en plasmid av bakteriellt ursprung. En plasmid är en dubbelsträngad, cirkulär DNA-molekyl som finns naturligt i bakterier. De är främmande för bakteriekromosomen - det vill säga de är extrakromosomala och finns naturligt i dessa prokaryoter.

De grundläggande elementen i en vektor är: (a) ett replikationsursprung, vilket möjliggör DNA-syntes; (b) selektionsmedel, vilket gör det möjligt att identifiera organismerna som bär plasmiden med mål-DNA, såsom resistens mot vissa antibiotika; och (c) multikloningsställe, där sekvenserna som kommer att igenkännas av restriktionsenzymerna finns.

Det första framgångsrika rekombinanta DNA i laboratoriet klonades in i plasmiden pSC101 från bakterien E. coli. Detta innehåller ett restriktionsställe för restriktionsenzymet EcoRI och en gen för resistens mot ett antibiotikum, utöver replikationsursprunget.

Insättningen av mål-DNA i plasmiden utförs med användning av molekylära verktyg för restriktionsenzymer och ligaser beskrivna i föregående avsnitt.

Återstående vektortyper

Förutom plasmider kan DNA sättas in i annan vektor, såsom bakteriofag-lambda, kosmider, YAC: er (artificiella jästkromosomer), BAC: er (bakteriella artificiella kromosomer) och fagemider.

3. Introduktion av rekombinant DNA

När den rekombinanta DNA-molekylen (gen av intresse i plasmiden eller annan vektor) har erhållits införs den i en värd eller värdorganism, som kan vara en bakterie.

För att införa främmande DNA i en bakterie används en teknik som kallas bakterietransformation, där organismen underkastas en behandling med tvåvärda katjoner som gör den mottaglig för DNA-upptag.

Metodologiskt kan vi inte garantera att 100% av bakterierna i vår kultur effektivt har tagit upp vår rekombinanta DNA-molekyl. Det är här den del av plasmiden som innehåller antibiotikaresistens kommer in.

Således kommer bakterierna som har tagit upp plasmiden vara resistenta mot ett visst antibiotikum. För att välja dem, räcker det att applicera nämnda antibiotika och ta överlevande.

4. "Skörda" proteinet

Efter att vi har valt bakterierna med vårt rekombinanta DNA fortsätter vi att använda värdens enzymatiska maskiner för att generera proteinprodukten av intresse. När bakterierna reproduceras överförs plasmiden till deras avkommor, så att den inte går förlorad under uppdelningen.

Denna procedur använder bakterierna som en slags protein "fabrik". Senare kommer vi att se att det har varit ett mycket relevant förfarande för utveckling av effektiva medicinska behandlingar.

När kulturen är klar och bakterierna har producerat stora mängder protein lyseras eller störs cellen. Det finns ett brett utbud av biokemiska tekniker som möjliggör rening av proteiner enligt deras fysisk-kemiska egenskaper.

I ett annat experimentellt sammanhang kanske vi inte är intresserade av att generera proteinet, utan snarare är vi intresserade av att erhålla DNA-sekvensen i sig. Om detta var fallet skulle plasmiden användas för att skapa flera kopior av det fragment som intresserar oss för att ha tillräckligt med mål-DNA för att utföra de relevanta experimenten.

tillämpningar

Rekombinant DNA-teknik öppnade ett oändligt antal möjligheter inom molekylärbiologi, bioteknik, medicin och andra relaterade områden. Dess mest framstående applikationer är följande.

Genetisk analys

Den första applikationen är direkt relaterad till molekylärbiologilaboratorier. Rekombinant DNA-teknik gör det möjligt för forskare att förstå generens normala funktion, och de genererade proteinerna kan användas i vidare forskning.

Läkemedelsindustri

Proteiner producerade med användning av rekombinant DNA-proceduren har tillämpningar inom medicin. Två mycket relevanta exempel på området är humant insulin och tillväxthormon, som tillämpas på patienter som saknar detta protein.

Tack vare rekombinant DNA kan dessa proteiner genereras utan att behöva extrahera dem från en annan människa, vilket representerar ytterligare metodologiska komplikationer och hälsorisker. Detta har bidragit till att förbättra livskvaliteten för otaliga patienter.

referenser

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologi 2. Grupo Redaktionella Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Cellen: en molekylär strategi (vol. 10). Washington, DC: ASM-press.
3. Devlin, TM (2004). Biokemi: lärobok med kliniska tillämpningar. Jag vänt.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Roll av rekombinant DNA-teknik för att förbättra livet. International journal of genomics, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologisk anatomi. Elsevier Spanien.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Introduktion till mikrobiologi. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Mänskligt insulin: DNA-teknikens första läkemedel. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.