CYTOKEMI: HISTORIA, STUDIEOBJEKT, ANVÄNDBARHET OCH TEKNIKER - BIOLOGI - 2025

Den cytokemi innefattar en serie av tekniker som förlitar sig på identifiering och disposition av specifika substanser inne i cellen. Det anses vara en gren av cellbiologi som kombinerar cellmorfologi med kemisk struktur.

Enligt Bensley, grundare av tillämpningen av modern cytologi, uttrycker det att syftet med cytokemi är att upptäcka den kemiska organisationen av celler för att förstå livets mysterier. Förutom att studera de dynamiska förändringarna som sker under de olika funktionella stadierna.

1: Pagets extramammärsjukdom. (Hematoxylin-Eosin) 2: senila plack observerade i hjärnbarken hos en patient med Alzheimers sjukdom. (Silverimpregnering) 3: Kanin tunga, kollagenfibrer (blå). Muskelfibrer (lila remsor). (Massons trikrom). 4: Levervävnad med fet degeneration. (Sudan III) 5: Inflammerad lever. Nekros. (Toluidine blue) Källor: Wikipedia. com / Användare: KGH / Public Domain-filer / Mohit Lalwani

På detta sätt är det möjligt att bestämma den metaboliska roll som dessa ämnen spelar i cellen.

Cytokemi använder två huvudmetoder. Den första är baserad på kemiska och fysiska procedurer. Dessa tekniker tillämpar användningen av mikroskopet som ett oumbärligt instrument för att visualisera de kemiska reaktionerna som inträffar på specifika ämnen i cellen.

Exempel: användningen av cytokemiska färgämnen, såsom Feulgen-reaktion eller PAS-reaktion, bland andra.

Den andra metoden är baserad på biokemi och mikrokemi. Med denna metod är det möjligt att kvantitativt bestämma närvaron av intracellulära kemikalier.

Bland ämnena som kan avslöjas i en vävnad eller cellstruktur är följande: proteiner, nukleinsyror, polysackarider och lipider.

Cytokemihistoria

Cytokemiska tekniker sedan uppfinningen har bidragit till att förstå cellernas sammansättning, och med tiden har en mängd olika tekniker framkommit som använder olika typer av färgämnen med olika affiniteter och grundläggande faktorer.

Därefter öppnade cytokemi nya horisonter med användning av vissa substrat för att visa kolorimetriskt närvaron av enzymer eller andra molekyler i cellen.

På liknande sätt har andra tekniker framkommit såsom immunocytokemi som har varit till stor hjälp vid diagnosen många sjukdomar. Immunocytokemi är baserad på antigen-antikroppsreaktioner.

Å andra sidan har cytokemi också använt fluorescerande ämnen som kallas fluorokromer, vilket är utmärkta markörer för detektering av vissa cellstrukturer. På grund av egenskaperna hos fluorokrom belyser det strukturerna till vilka det har fästs.

Vad studerar du?

De olika cytokemiska teknikerna som används på ett biologiskt prov har något gemensamt: de avslöjar närvaron av en specifik typ av ämne och känner till dess placering inom den biologiska strukturen som utvärderas, vare sig det är en celltyp eller en vävnad.

Dessa ämnen kan vara enzymer, tungmetaller, lipider, glykogen och definierade kemiska grupper (aldehyder, tyrosin, etc.).

Informationen som tillhandahålls med dessa tekniker kan ge vägledning inte bara för identifiering av celler utan också för diagnos av olika patologier.

Till exempel är cytokemiska fläckar mycket användbara för att skilja mellan de olika typerna av leukemier, eftersom vissa celler uttrycker vissa enzymer eller nyckelämnen och andra inte.

Å andra sidan bör det noteras att för användning av cytokemi ska följande hänsyn tas:

1) Ämnet måste immobiliseras på den plats där det finns naturligt.

2) Ämnet måste identifieras med hjälp av substrat som reagerar specifikt med det och inte med andra föreningar.

Verktyg

Proven som kan studeras med cytokemiska tekniker är:

- Utökat perifert blod.

- Utökad benmärg.

- Vävnader fixerade för histokemiska tekniker.

- Celler fixerade genom cytocentrifugering.

Cytokemiska tekniker är mycket stödjande inom hematologin, eftersom de används ofta för att hjälpa till att diagnostisera och differentiera vissa typer av leukemier.

Exempel: Esterasreaktioner används för att differentiera myelomonocytisk leukemi från akut monocytisk leukemi.

Benmärgs- och perifert blodutstryk från dessa patienter är lika, eftersom vissa celler är svåra att identifiera morfologiskt enbart. För detta utförs esterastest.

I den första är specifika esteraser positiva, medan i den andra är ospecifika esteraser positiva.

De är också mycket användbara inom histologi, eftersom till exempel användningen av tungmetallfärgningsteknik (silverimpregnering) färgar retikulära fibrer med en intensiv brun färg i hjärtvävnaden.

Tekniker inom cytokemi

De mest använda teknikerna kommer att förklaras nedan:

- Användning av färgämnen

De använda fläckarna är mycket olika i cytokemiska tekniker och dessa kan klassificeras enligt flera synvinklar:

Enligt radikalen som de har en affinitet för

De är indelade i: sura, basiska eller neutrala. De är de enklaste och mest använda genom historien, vilket gör att vi kan skilja de basofila komponenterna från de acidofila. Exempel: hematoxylin-eosinfärgning.

I det här fallet färgar cellernas kärnor blått (de tar hematoxylin, som är det grundläggande färgämnet) och cytoplasmerna, röda (de tar eosin, som är det sura färgämnet).

Beroende på färgen de ger

De kan vara ortokromatiska eller metakromatiska. Ortokromatiken är de som färgar strukturerna i samma färg som färgämnet har. Till exempel fallet eosin, vars färg är röd och fläckar röd.

Å andra sidan strukturerar metakromatik en annan färg än deras, till exempel toluidin, vars färg är blå och ändå fläckar violetta.

Vitala eller supravitala färgämnen

Det är ofarliga färgämnen, det vill säga de färgar celler och håller sig vid liv. Dessa fläckar kallas livsviktiga (t.ex. trypanblå för att fläcka makrofager) eller supravitala (t.ex. Janus grön för att fläcka mitokondrier eller neutral röd till fläcklysosomer).

- Detektion av lipider med fettlösliga färgämnen

Osmiumtetroxid

Det fläckar lipider (omättade fettsyror) svart. Denna reaktion kan observeras med ljusmikroskopet, men eftersom detta färgämne har hög densitet kan det också visualiseras med ett elektronmikroskop.

Sudan III

Det är en av de mest använda. Detta färgämne diffunderar och solubiliseras i vävnaderna och ackumuleras inuti lipiddropparna. Färgen är röd.

Sudans svart fläck B

Det ger bättre kontrast än de tidigare eftersom det kan lösa sig också i fosfolipider och kolesterol. Det är användbart för att detektera azurofila och specifika granuler av mogna granulocyter och deras föregångare. Därför identifierar den myeloida leukemier.

- Aldehydgruppfärgning (periodisk syra Schiff-fläck)

Periodisk syra Schiff-fläck kan upptäcka tre typer av aldehydgrupper. Dom är:

- Gratis aldehyder, naturligt närvarande i vävnader (plasmareaktion).

- Aldehyder producerade genom selektiv oxidation (PAS-reaktion).

- Aldehyder genererade genom selektiv hydrolys (Feulgen-reaktion).

PAS-reaktion

Denna färgning är baserad på att detektera vissa typer av kolhydrater, såsom glykogen. Periodisk syra Schiff bryter CC-bindningarna av kolhydrater på grund av oxidation av glykoliska grupper 1-2, vilket lyckas frigöra aldehydgrupper.

Fria aldehydgrupper reagerar med Schiffs reagens och bildar en lila-röd förening. Utseendet på den lila-röda färgen visar en positiv reaktion.

Detta test är positivt i växtceller, detekterar stärkelse, cellulosa, hemicellulosa och peptiner. I djurceller upptäcker den muciner, mukoproteiner, hyaluronsyra och kitin.

Dessutom är det användbart vid diagnos av lymfoblastiska leukemier eller erytroleukemi, bland andra patologier av den myelodysplastiska typen.

I fallet med sura kolhydrater kan den alcianblå fläcken användas. Testet är positivt om en ljusblå / turkos färg observeras.

Plasmal reaktion

Plasmareaktionen avslöjar närvaron av vissa långkedjiga alifatiska aldehyder såsom handflata och stearal. Denna teknik används på frysta histologiska sektioner. Det behandlas direkt med Schiffs reagens.

Feulgen reaktion

Denna teknik detekterar närvaron av DNA. Tekniken består av att utsätta den fasta vävnaden för en svag sur hydrolys för att senare få den att reagera med Schiffs reagens.

Hydrolys exponerar deoxiribosaldehydgrupperna vid deoxiribos-purinbindningen. Schiffs reagens reagerar sedan med aldehydgrupperna som lämnades fria.

Denna reaktion är positiv i kärnorna och negativ i cellernas cytoplasmer. Positiviteten framgår av närvaron av en röd färg.

Om denna teknik kombineras med metylgrön-pyronin är det möjligt att samtidigt detektera DNA och RNA.

- Cytokemiska fläckar för proteinstrukturer

För detta kan Millon-reaktionen användas, som använder kvicksilvernitrat som reagens. Strukturer som innehåller aromatiska aminosyror färgar rött.

- Cytokemiska fläckar som använder substrat för att visa närvaron av enzymer

Dessa fläckar är baserade på inkuberingen av det biologiska provet med ett visst substrat och reaktionsprodukten reagerar därefter med diazosalter för att bilda ett färgat komplex.

esteraser

Dessa enzymer finns i lysosomerna i vissa blodceller och kan hydrolysera organiska estrar som frisätter naftol. Den senare bildar ett olösligt azofärgämne när det binder till ett diazosalt, vilket färgar platsen där reaktionen inträffar.

Det finns flera substrat och beroende på vilket som används kan specifika esteraser och icke-specifika esteraser identifieras. De förstnämnda är närvarande i omogna celler i myeloida serien och de senare i celler av monocytiskt ursprung.

Substratet som används för bestämning av specifika estaser är: naftol-AS-D kloroacetat. Medan för bestämning av icke-specifika esteraser kan flera substrat användas, såsom naftol AS-D-acetat, alfa-naftylacetat och alfa-naftylbutyrat.

I båda fallen fläckar cellerna djupt rött när reaktionen är positiv.

myeloperoxidas

Detta enzym finns i de azurofila granulerna av granulocytiska celler och monocyter.

Dess detektering används för att differentiera leukemier av myeloida ursprung från lymfoida. Celler som innehåller myeloperoxidaser blir okergul.

fosfataser

Dessa enzymer frisätter fosforsyror från olika substrat. De skiljer sig från varandra beroende på substratets specificitet, pH och verkan av hämmare och inaktiveringsmedel.

Bland de mest kända är fosfomonoesteraser som hydrolyserar enkla estrar (PO). Exempel: alkaliskt fosfatas och surt fosfatas, samt fosfamidaser som hydrolyserar bindningarna (PN). Dessa används för att differentiera lymfoproliferativa syndrom och för diagnos av hårig cell leukemi.

- Trikromiska färgläggningar

Mallary-Azan Trichrome

De är användbara för att differentiera cytoplasma hos celler från fibrerna i bindväv. Celler fläckar röda och kollagenfibrer blå.

Massons trikrom

Detta har samma användbarhet som den föregående men i detta fall färgar cellerna röda och kollagenfibrerna gröna.

- Färgämnen som färgar specifika organeller

Janus Green

Det fläckar selektivt mitokondrierna.

Silversalter och osminsyra

Fläckar Golgi-apparaten.

Toluidinblått

Fläckar Nissis kroppar

Silversalter och PAS

De fläckar retikulära fibrer och basalamina.

Orcein och fuchsin resorcin

De färgar elastiska fibrer. Med den första är de färgade bruna och med den andra djupblå eller lila.

- Andra tekniker som används i cytokemi

Användning av fluorescerande ämnen eller fluorokrom

Det finns tekniker som använder fluorescerande ämnen för att studera platsen för en struktur i en cell. Dessa reaktioner visualiseras med ett speciellt mikroskop som kallas fluorescens. Exempel: IFI-teknik (indirekt immunfluorescens).

Detektion av cellulära komponenter genom immunocytokemi

Dessa tekniker är mycket användbara inom medicinen eftersom de hjälper till att upptäcka en viss cellstruktur och också kvantifiera den. Denna reaktion är baserad på en antigen-antikroppsreaktion. Till exempel: ELISA-tekniker (Enzyme Immuno Assay).

rekommendationer

- Det är nödvändigt att använda kontrollutstryk för att utvärdera färgämnets goda prestanda.

- Färska utstryk bör användas för att genomgå cytokemisk färgning. Om det inte är möjligt ska de hållas skyddade mot ljus och förvaras vid 4 ° C.

- Se till att fixativet som används inte påverkar det ämne som ska undersökas negativt. Med andra ord måste det förhindras från att kunna extrahera eller hämma det.

- Tidpunkten för användning av fixeringsmedlen måste respekteras, eftersom det i allmänhet endast ska pågå i sekunder, eftersom att utsättningen för en längre tid utsätts för fixativet kan skada vissa enzymer.

referenser

1. "Cytochemistry." Wikipedia, den fria encyklopedin. 30 juni 2018, 17:34 UTC. 9 jul 2019, 02:53 Finns i: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metallimpregneringsmetoder för studier av hjärt-retikulära fibrer: Jämförande studie. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Finns på: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytokemi för surt fosfatas: metodologiska överväganden. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Finns på: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Cellulär och molekylärbiologi. 11: e upplagan. Redaktion Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Klassiska verktyg för att studera cellbiologi. TP 1 (kompletterande material) - Cellbiologi. Finns på: dbbe.fcen.uba.ar