BAKTERIELL UTSTRYKNING: EGENSKAPER OCH BEREDNING - BIOLOGI - 2024

Den bakteriella utstryk är en tunn film utstryk av en suspension av bakterie mikroorganismer som är gjord på en transparent glasplatta eller objektglas, för observation under ett ljusmikroskop.

Förlängningen i form av en film utförs för att separera mikroorganismerna så mycket som möjligt, eftersom om de är grupperade är observationen inte klar.

Figur 1. Bakteriell utstryk sett under ett avsökande elektronmikroskop. Källa: pixbay.com

I studien av bakteriekulturer används smetberedning, fixering och färgningstekniker för att bättre analysera dem. På grund av den lilla storleken av mikroorganismer krävs nödvändigtvis användning av ett optiskt mikroskop för deras observation.

Optiska mikroskop är viktiga instrument för att observera utstryk. Dessa använder optiska linser och ljus som möjliggör visning av proverna med hög förstoring.

I allmänhet har levande celler inte mestadels färgade strukturer, sett med ljusmikroskopet är de färglösa, transparenta prover, och de visar väldigt liten inre kontrast och med sin miljö.

Observation med det enkla ljusfältljusmikroskopet, utan användning av hjälpfärgningstekniker, är mycket begränsad och används endast i vissa fall, till exempel för observation av mikroorganismernas rörelse.

För optimal observation av mikroorganismer måste en balans uppnås mellan kontrast och upplösning. Celldetaljer kan inte ses under ett mikroskop, inte ens med hög upplösning; Användning av färgämnen krävs genom färgningstekniker, som ger kontrast för observation.

Egenskaper av bakteriesprut av god kvalitet

Utmärkt kontrast

För att uppnå utmärkt kontrast finns sofistikerade mikroskop som kallas faskontrastmikroskop, differentiella interferensmikroskop och mörka fältmikroskop. Denna typ av mikroskop används för att observera bland annat bakteriella strukturer såsom mantlar och filament.

Färgning är en enkel teknik för att öka kontrasten som uppnås med ett ljusfältmikroskop. I denna teknik kan olika fläckar användas, vilket avsevärt förbättrar mikroskopisk observation.

Fläckarna utförs direkt på utstryk eller förlängningar av mikroorganismupphängningarna på objektglasen, tidigare torkade och fixerade.

Bra fix

Fixering är en teknik som används för att bevara cellstrukturer; orsakar inaktivering av mikroorganismer och vidhäftning till glasets glas. Det finns olika fixeringsbehandlingar: värmefixering och kemisk fixering.

Värmefixering

Detta är den mest använda metoden för att observera bakteriesprick. Tekniken består av att leda bakteriesuspensionen av smet genom en tändare. Denna teknik kan bevara den yttre morfologin hos bakterier, men förstör deras inre strukturer.

Kemisk fixering

Kemisk fixering använder konserveringskemikalier, såsom formaldehyd eller formalin, etanol och ättiksyra, bland andra. Fördelen med att använda kemiska fixeringsmedel är att bevarandet av de inre cellulära strukturerna i mikroorganismerna uppnås.

Bild 2. Blodsmetning. Källa: Bobjgalindo, från Wikimedia Commons

Bra färgning

De vanligaste procedurerna för färgning av en tidigare torkad och fixerad smetning är positiv eller enkel färgning, differentiell färgning och negativ färgning. Det finns också speciella tekniker för färgning av specifika cellstrukturer (kapsel, spore, flagella).

Positiv färgning eller enkel färgning

Positiv eller enkel färgning är den mest använda smetfärgningstekniken. Den använder färgämnen som har förmågan att binda till vissa mikrobiella strukturer, vilket gör att de kan observeras under ett mikroskop.

Dessa färgämnen har kromoforgrupper (färgad del) i sin kemiska struktur, med alternerande dubbelbindningar och enkelbindningar (konjugering). Dessa bindningar kan i sin tur upprätta joniska eller kovalenta bindningar med vissa cellstrukturer.

Färgämnen som används vid positiv eller enkel färgning är mestadels kemiska derivat av anilin (färgade organiska salter).

Å andra sidan, bland färgämnen kan vi hitta några med ett basiskt pH och andra med ett surt pH.

Grundläggande färgämnen

Vid basiska färgämnen har kromoforgruppen en positiv elektrisk laddning. De allra flesta prokaryota mikroorganismer har ett neutralt inre pH och deras cellyta är negativt laddad. Genom denna elektrostatiska interaktion binder kromoforen till cellen och färgar den.

Exempel på basiska färgämnen är metylenblått, kristallviolett, malakitgrönt, basisk fuscin, safranin, bland andra.

Syrafärgämnen

I sura färgämnen har kromoforgruppen en negativ elektrisk laddning. Dessa används för att färga proteiner med positivt laddade aminogrupper. Exempel på sura färgämnen är syrafuscin, rosenbengalen, Kongoröd och eosin.

Differentialfärgning

Den differentiella färgningstekniken består av att applicera två färgämnen med olika färg eller intensitet för att skilja olika mikroorganismer under mikroskopet. Gram-fläcken och den sura-alkoholresistenta fläcken är de vanligaste differentiella fläckarna i bakteriologi.

Gram-fläcken används som ett preliminärt test för att känna till form, storlek, cellgruppering och typ av cellvägg. Med hjälp av Gram-fläcktestet klassificeras cellväggsbakterier i Gram-positiva bakterier och Gram-negativa bakterier.

Negativ färgning

I denna teknik används kemiska färgämnen som inte tränger in i det inre av cellen, men gör det medium där mikroorganismerna förekommer som en svart bakgrund.

I den negativa färgningstekniken framställs smetet med en droppe indisk bläck eller nigrosinsuspension, som efter tillåtelse av torkning vid rumstemperatur bildar en ogenomskinlig film till passagen av ljus. På detta sätt visas mikroorganismer som ljusa former på en mörk bakgrund.

Förberedelse

A. Smet

1.- Tvätta objektglasen mycket väl, torka med absorberande papper och märk dem. Etiketten måste ange innehållet i beredningen, datumet och namnet på den som behandlade det.

2.- Tänd tändaren och sterilisera inokuleringsslingan i lågan tills den är röd.

3.- Låt handtaget svalna.

4.- Ta bakteriekulturröret, ta av locket och passera rörets mun nära brännarens låga (flamma).

5.- Sätt in inokuleringsslingan i röret som innehåller bakteriekulturen och ta provet.

6.- Om kulturen är i flytande medium placerar du provet som tagits med handtaget i mitten av objektglaset och sprider det försiktigt i en cirkel med cirka 2 cm i diameter.

7.- Sterilisera inokuleringsslingan igen.

8.- Låt utstryket torka i luften.

9.- Upprepa steg 3 till 8 tre gånger.

10.- Om kulturen är i fast medium måste en droppe destillerat vatten tidigare placeras på objektglaset. Detta görs för att blanda ett litet prov av kulturen taget med ympningsslingan, enligt anvisningarna i steg 2 till 5 (aseptiska förhållanden).

11.- Sprid det utspädda provet med droppen vatten på objektglaset och upprepa tre gånger.

B. Fixering

1.- Tillsätt två droppar metanol eller absolut etanol till det torra utstryket - från kulturer i flytande medium -.

2.- Låt lufttorka bort från tändaren.

3.- Om utstryket kommer från en kultur på fast medium fixeras torrutstrykningen med värme och leder den snabbt 2 till 3 gånger genom den hetaste delen av den ljusare lågan.

4.- Rör vid den nedre delen av smet med vänsterhandens ryggdel (för högerhand, använd annars höger hand) och kontrollera att det är kallt.

C. Enkel färgning

1.- Tillsätt 2 droppar av den valda fläcken i smet och låt den agera under den tid som krävs i de specifika protokollen för varje fläck (vanligtvis mellan 1 och 5 minuter).

2.- Vissa fläckar kräver användning av värme för att aktiveras, i vilket fall måste man vara mycket försiktig när du upphettar gliden i den ljusare lågan (manipulera den med pincett och undvik kokning). Överhettning av smet kan förstöra cellerna som ska observeras.

3.- Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta med destillerat vatten från en picett. Ta bort tvättvattnet genom att knacka försiktigt på objektglaset på sin kant, lutat på arbetsbordet.

4.- Låt lufttorkning.

5.- Beroende på observationstyp används ett täckglas eller inte i detta skede. Täckglaset skyddar och bevarar smet. Om man observerar en nedsänkning av olja i detta skede används inga täckglas men smet kan inte bevaras.

D. Definitivt bevarande av smet

1.- Sänk ned smältet successivt i var och en av de nedanstående lösningarna, i minst 5 minuter. Syftet med dessa "bad" är att helt dehydrera smet. Varje reagens bör dräneras noggrant innan smöret införs i nästa bad.

Ordningen för dehydratiserande baden är som följer:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Ren aceton
4. Aceton-xylol 1: 1-blandning
5. xylol

Låt sedan lufttorka.

2.- Montera täckglaset, helst 22 × 22 mm, med Canada balsam eller annat monteringsmedium.

referenser

1. Briggs, G. (1965). Orsaksfaktorer vid mikrobiologiska laboratorietillfällen och infektioner. US Army Biologiska laboratorier. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG och Welch, CT (2017). Microbiology: A Laboratory Manual. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). Den kortare Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8: ^e Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR och Case; CL (2018). Laboratorieexperiment i mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14: ^e St. Louis, USA: Elsiever, Inc.