CATALASE TEST: SKÄL, TEKNIK OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDEN - BIOLOGI - 2025

Den katalas-test är en metod som används i bakteriologi laboratorier för att avslöja närvaron av enzymet katalas i dessa bakterier som besitter den. Tillsammans med Gram-fläcken är de de viktigaste testerna som bör utföras på nyligen isolerade mikroorganismer. Dessa tester guidar mikrobiologen i stegen att följa för att definiera den aktuella mikroorganismen.

I allmänhet har bakterier som innehåller cytokrom enzymet katalas, vilket innebär att fakultativa aeroba och anaeroba bakterier bör ha det. Det finns emellertid undantag, såsom Streptococcus, som trots att de är fakultativa anaeroba mikroorganismer inte har enzymkatalaset.

Körning av Catalase Test och visar en positiv reaktion. Källa: Ingen maskinläsbar författare tillhandahålls. Nase antog (baserat på upphovsrättsanspråk).

Därför används katalasstestet främst för att skilja Staphylococaceae- och Micrococaceae-familjerna (båda katalas-positiva) från familjen Streptococaceae (katalas negativ).

På samma sätt skiljer man släkten Bacillus (katalasepositivt) från släkten Clostridium (katalasnegativ) bland andra.

Grund

Katalas är ett enzym som klassificeras som en hydroperoxidase, Detta innebär att de använder väteperoxid (H ₂ O ₂ ) som ett substrat .

Det betraktas också som ett oxidoreduktas, eftersom det i reaktionen där det deltar finns ett element som fungerar som en elektrondonator (reducerande substans) och en annan som en elektronreceptor (oxiderande substans).

Catalase är ett protein som innehåller en proserisk grupp med fyra trivalenta järnatomer (Fe ⁺⁺⁺ ), därför är det ett homoprotein. Järnjonen förblir oxiderad under reaktionen.

Det kan sägas att katalas är ett avgiftande enzym, eftersom dess funktion är att eliminera ämnen som produceras under bakteriell metabolism som är giftiga för bakterier. Bland dessa ämnen är väteperoxid.

Väteperoxid bildas genom nedbrytning av sockerarter aerobt. Denna process sker enligt följande:

Superoxid jon (O ₂ ^- ) (fri radikal) är utformad som slutprodukten av assimilering av glukos genom den aeroba vägen. Detta är giftigt och elimineras av enzymet superoxiddismutas som omvandlar det till gasformigt syre och väteperoxid.

Väteperoxid är också giftigt för bakterier och måste tas bort. Enzymkatalaset bryter ner väteperoxid i vatten och syre.

Katalas kan verka på andra substrat än väteperoxid, såsom alkoholer, aldehyder, syror, aromatiska aminer och fenoler. Väteperoxid kan emellertid också användas genom katalas för att oxidera andra toxiska föreningar såsom metyl och etylalkohol.

På samma sätt är katalas närvarande i fagocytiska celler, vilket skyddar det från den toxiska verkan av väteperoxid.

Rutinteknik för katalasatest

-Slide-metod

material

3% väteperoxid (10 volymer).

Mikroskopglas

Engångsplasthandtag eller tandpetare av trä.

Bearbeta

Ta tillräckligt med kolonin för att studera utan att vidröra agaren från vilken den kom. Kolonin måste vara färsk, det vill säga från en kultur på 18 till 24 timmar.

Placera kolonin på den torra objektglaset och tillsätt en droppe 3% väteperoxid till den ( 30% H ₂ O ₂ kan också användas ). Se omedelbart om bubblor släpps eller inte.

tolkning

Positiv reaktion: gasutveckling, bevisad av bildandet av bubblor (stark bubbla).

Negativ reaktion: ingen bubbelbildning.

-Direkt metod i ren kultur

Ställe 1 ml 3% H ₂ O ₂ på en ren platta eller kil kultur som inte innehåller blod (företrädesvis näringsagar). Observera om det finns bubbelbildning direkt eller inte. 30% H ₂ O ₂ kan också användas .

Det tolkas på samma sätt som porta-objektmetoden.

-Metod med kapillärrör eller Fung and Petrishko

Fyll ett 67 mm kapillärrör till en höjd av 20 mm med 3% väteperoxid efter kapillaritet.

Vidröra isolerad koloni som skall studeras med kapillär fylld med 3% H ₂ O _{2 .} Observera om kapillären fylls med bubblor på cirka 10 sekunder. Denna metod tillåter semikvantifiering av reaktionen i kors:

Utan kors finns det inga bubblor (negativ reaktion).

+ ---- Få bubblor (svag eller försenad reaktion).

++ --– Rikliga bubblor (måttlig reaktion).

+++ - Bubblor når motsatt ände (stark reaktion).

-Taylor och Achanzar-metoden för katalasstest som ger tvivelaktiga

Placera en isolerad koloni på en ren, torr slid, sedan placera en droppe av 0,5% H ₂ O ₂ och täck med ett täckglas. Observera om det bildas fångade bubblor eller inte.

Tolkning: närvaron av bubblor indikerar en positiv reaktion. Inga bubblor, det tolkas som en negativ reaktion.

Catalasestest för Mycobacterium-arter

Denna teknik måste göras genom att kontrollera pH och temperatur. Det måste utföras under en laminär flödeshuva, eftersom hanteringen av de olika Mycobacterium-arterna är farlig.

-Material

Väteperoxid 30% eller 110 volymer (superoxal).

Fosfatbuffert pH 7

10% mellan 80

Mycobacterium kilkultur i 3 till 4 veckor

-Förberedelse

Fosfatbuffert pH 7

Att väga:

1,361 g av vattenfri monokaliumfosfat (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g vattenfri dinatrium (Na2HPO3) fosfat.

Lös upp båda salterna i lite sterilt destillerat vatten och fyll på upp till 1000 ml med vatten.

10% mellan 80

Gör en utspädning av 1:10 till Tween 80 som är kommersiellt koncentrerad, för att göra detta fortsätter enligt följande:

Ta 1 ml Tween 80 och placera den i lite destillerat vatten, upplös och fyll sedan volymen med vatten till 10 ml.

Slutreagens

Blanda en mängd fosfatbuffert med en mängd av 10% Tween 80 (lika delar). Definiera i laboratoriet hur mycket du vill förbereda.

-Bearbeta

Placera 5 ml fosfatbuffert i ett sterilt skruvkapslad provrör (Bakelite).

Ta med tillräckligt med kolonier av en Mycobacterium-tillväxt som är utsäkt i kil och löst i fosfatbufferten med en ympningsslinga.

Täck röret utan att dra åt tråden överdrivet. Placera i vattenbad vid 68 ° C i 20 till 30 minuter. Ta ut och låt svalna till 22-25 ° C

Mät 0,5 ml av det slutliga reagenset (blanda) och tillsätt det i röret med den kalla lösningen. Observera bildandet eller inte av bubblor.

Det tolkas på samma sätt som tidigare tekniker.

Använda sig av

När kolonitillväxt uppnås i anrikat medium bör en Gram-fläck och ett katalasstest utföras på de erhållna kolonierna. Detta kommer att vägleda mikrobiologen om de procedurer som ska följas för definitiv identifiering.

Källa: Utarbetad av författaren MSc. Marielsa gil

QA

För att utvärdera väteperoxidreagensens goda prestanda använd nyodlade kontrollstammar, såsom Staphylococcus aureus som en positiv kontroll och Streptococcus sp-stammar som en negativ kontroll.

Ett annat alternativ som fungerar som en positiv kontroll är att placera en droppe väteperoxid på blodagaren, erytrocyterna har katalas, därför kommer det att bubbla om reagenset är i gott skick.

En chokladagar kan användas som en negativ kontroll, här är erytrocyterna redan lyserade och testet är negativt.

begränsningar

-Använd inte gamla kulturer för testet, eftersom det kan orsaka falska negativ.

- Undvik att ta kolonier från kulturer på blodagar, om du är noga med att inte röra agar; Denna procedur kan leda till falska positiver, eftersom röda blodkroppar innehåller katalas.

-Om du tar kolonin med ett platinahandtag, vänd inte ordningen på proceduren eftersom det kan ge falska positiver. Detta beror på att platina kan reagera med väteperoxid och orsaka bubblor.

-Använd inte väteperoxidreagenset om det är väldigt gammalt, eftersom reagenset är mycket instabilt och tenderar att gå sönder med tiden.

- Håll väteperoxidreagensen skyddad från ljus och kyls för att förhindra skador.

-Gör en kvalitetskontroll av väteperoxidreagenset varje gång det används.

-Ta hänsyn till att om 30% H ₂ O ₂ används, de reaktioner som är starkare än de som utförs med 3% H ₂ O ₂ .

referenser

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Redaktör Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemiska tester för identifiering av bakterier av klinisk betydelse. 3: e upplagan Redaktionell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. BD-laboratorier. Catalase-Gotario reagens. Finns på: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Peroxid. Ekvivalens mellan volymer och procent. Finns på: vadequimica.com