SPORFÄRGNING: SKÄL, TEKNIKER OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDEN - BIOLOGI - 2025

Den spor-färgning är den metod som används för att färga motståndsstrukturer, vilka bildar en del bakteriesläkten när under ogynnsamma förhållanden; Dessa strukturer motsvarar en form för överlevnad.

Det finns många släkter som bildar sporer; de viktigaste är emellertid Bacillus och Clostridium. Dessa släkter anses vara mer relevanta eftersom de har patogena arter för människor.

Sporfärgning med Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin-metoden. Och tambe (originaluppladdare), från Wikimedia Commons

Varje bacillus kan ge upphov till en spore. Vid färgningstillfället kan sporen hittas i bacillus (endospore) eller utanför den (exospore). Med konventionella färgningstekniker för bakterier - som Gram-fläcken - förblir sporerna färglösa.

För närvarande finns det flera färgningsmetoder som kan tränga igenom den tjocka strukturen i sporen för att färga den. Dessa metoder är mycket varierande; Dessa inkluderar Dorner-tekniken, Möeller-fläcken och Shaeffer-Fulton-metoden, även känd som Wirtz-Conklin.

Av alla nämnda tekniker är Shaeffer-Fulton-metoden den mest använda i rutinlaboratorier. Den är uppkallad efter två mikrobiologer som skapade färgen 1930: Alicia Shaeffer och MacDonald Fulton. Emellertid benämns tekniken ibland Wirtz-Conklin efter två bakteriologer från 1900-talet.

Grund

Sporerna fläckar inte med konventionella fläckar eftersom de har en mycket tjock vägg. Sporernas komplexa sammansättning förhindrar inträde av de flesta färgämnen.

Om sporen studeras från utsidan till insidan, observeras följande lager: först är det exosporium, som är det tunnaste och yttre skiktet som bildas av glykoproteiner.

Därefter kommer nagelbandet, som ger motstånd mot höga temperaturer, följt av barken sammansatt av peptidoglykan. Senare är basens vägg som skyddar protoplasten.

Sporen är en dehydratiserad struktur som innehåller 15% kalcium och dipicolinsyra. Därför förlitar de flesta sporerfärgningstekniker applicering av värme så att färgämnet kan tränga igenom den tjocka strukturen.

När sporen är färgad kan den inte ta bort färgämnet. I Shaeffer - Fulton-tekniken kommer malakitgrönt in i vegetativa celler och, när värme appliceras, tränger det in i endosporen såväl som exosporerna.

Genom att tvätta med vatten avlägsnas färgämnet från den vegetativa cellen. Detta inträffar eftersom det malakitgröna färgämnet är något grundläggande, så det binder svagt till den vegetativa cellen.

Istället kan den inte komma ut ur sporen och så småningom försämras bacillen med safranin. Denna grund är giltig för resten av teknikerna, där något liknande händer.

Spore-färgningstekniker

För att utföra sporfärgningen måste en ren kultur av den misstänkta stammen som ska studeras erhållas.

Kulturen utsätts för extrema temperaturer i 24 timmar för att stimulera mikroorganismen att sporulera. För detta kan kulturen placeras i en ugn vid 44 ° C eller i kylskåp (8 ° C) i 24 eller 48 timmar.

Om det lämnas för länge vid de nämnda temperaturerna kommer endast exosporer att observeras, eftersom alla endosporer redan har lämnat bacillus.

I slutet av tiden bör några droppar steril fysiologisk lösning placeras på en ren bild. Sedan tas en liten del av kulturen och en fin spridning görs.

Därefter får den torka, fixeras i värmen och färgas med en av de tekniker som förklaras nedan:

Dorner teknik

1- Förbered i ett provrör en koncentrerad suspension av den sporulerade mikroorganismen i destillerat vatten och tillsätt en lika stor volym filtrerad Kinyoun-karbolfuchsin.

2- Placera röret i ett bad med kokande vatten i mellan 5 och 10 minuter.

3- Blanda en droppe av den tidigare suspensionen på en ren bild med en droppe av 10% vattenlösning av nigrosin, kokt och filtrerad.

4- Sprid och torka snabbt med svag värme.

5- Undersök med ett 100X mål (nedsänkning).

Sporerna fläckar röda och bakteriecellerna verkar nästan färglösa mot en mörkgrå bakgrund.

Modifierad Dorner-teknik

1- En suspension av den sporulerade mikroorganismen sprids på en bild och fixeras i värmen.

2- Provet täcks med en filterpappersremsa till vilken karbolfuchsin tillsätts. Färgmedlet upphettas i 5 till 7 minuter med Bunsen-brännarens låga tills utvecklingen av ångor genereras. Sedan tas papperet bort.

3- Beredningen tvättas med vatten och torkas sedan med absorberande papper.

4 - Täck utstrykningen med en tunn film av 10% nigrosin, använd en andra bild för att sprida nigrosinet eller en nål.

Färgen som tagits av sporerna och bakterierna är densamma som den som beskrivits i den tidigare tekniken.

Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin teknik

1- Gör en fin utstryk med en suspension av den sporulerade mikroorganismen på en bild och fixera den till värme.

2- Täcka bilden med 5% vattenhaltig malakitgrön vattenlösning (du kan placera ett filterpapper på objektglaset).

3- Värm över lågan på Bunsen-brännaren för att orsaka utsläpp av ångor och ta bort lågan. Upprepa åtgärden i 6 till 10 minuter. Om den malakitgröna lösningen avdunstar för mycket under proceduren kan mer läggas till.

4- Ta bort filterpapperet (om det är installerat) och tvätta med vatten.

5- Täck objektglaset med 0,5% vattenhaltigt safranin i 30 sekunder (vissa varianter av tekniken använder 0,1% vattenhaltigt safranin och lämna det i 3 minuter).

Med denna teknik verkar sporerna gröna och bacillerna röda.

Det har nackdelen att endosporerna för unga kulturer inte fläckar väl, eftersom de verkar extremt tydliga eller färglösa. För att undvika detta rekommenderas det att använda kulturer med 48 timmars inkubation.

Möeller teknik

1- Täck utstrykningen med kloroform i 2 minuter.

2- Kassera kloroformen.

3 - Täck med 5% kromsyra i 5 minuter.

4- Tvätta med destillerat vatten

5- Arket är täckt med carbol fuchsin-fenicada och utsätts för Bunsen-brännarens låga tills utsläpp av ångor; sedan avlägsnas den från lågan i några ögonblick. Operationen upprepas tills 10 minuter är slutförda.

6- Tvätta med vatten.

7- Använd surgjord etanol (saltsyra) för att missfärga. Den är kvar i 20 eller 30 sekunder.

8- Tvätta med destillerat vatten.

9- Kontrastinera genom att täcka arket med metylenblått i 5 minuter.

10- Tvätta med destillerat vatten.

11- Låt det torka och provet tas till mikroskopet.

Sporerna verkar röda och bacillerna blå. Det är viktigt att inte andas in ångorna, eftersom de är giftiga och på lång sikt kan vara cancerframkallande.

Modifierad Möeller-teknik utan värme

2007 skapade Hayama och hans medarbetare en modifiering av Möeller-tekniken. De eliminerade steget att värma färgämnet och ersatte det genom att tillsätta 2 droppar av det ytaktiva medlet Tergitol 7 för varje 10 ml karbol-fuchsin-karbol-lösning. Samma resultat erhölls.

tillämpningar

Färgningen av sporer ger mycket värdefull och användbar information för identifiering av patogenen, eftersom dess närvaro, dess form, placering inom bacillus och förmågan att deformera den vegetativa cellen eller inte, är data som kan vägleda arten involverad i en viss genre.

I detta sammanhang är det värt att säga att sporerna kan vara runda eller ovala, de kan vara belägna i mitten eller också i en paracentral, subminal eller terminal position.

Diagram över form och position för endosporer och exosporer

exempel

- Clostridium difficile bildar en oval spore i ett terminalläge som deformerar bacillen.

- Sporen av Clostridium tertium är oval, deformeras inte bacillus och är placerad på terminalnivå.

- Endosporen för Clostridium tetani är terminal och deformerar bacillusen, vilket ger upphov till en trumpinne.

- Sporerna från Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy och C. septicum är runda eller subterminala ovala och deformeras bacillus.

- Endosporen för Clostridium sordelli är belägen i det centrala läget med en lätt deformation.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. (5: e upplagan). Argentina, Redaktion Panamericana SA

referenser

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Förslag till en förenklad teknik för färgning av bakteriesporer utan applicering av värme - framgångsrik modifiering av Moellers metod. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia-bidragsgivare. Moeller-fläck. Wikipedia, den fria encyklopedin. 3 november 2018, 03:28 UTC. Finns på: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoriehandbok för mikrobiologiska tekniker. Institutionen för grundläggande vetenskapsakademi för mikrobiologi. National Polytechnic Institute.
4. "Endospores." Wikipedia, den fria encyklopedin. 25 feb 2018, 10:20 UTC. 10 jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J och kollaboratörer. (2006). Arbetstagare i den autonoma gemenskapen Extremadura. Särskild dagordning Volym IV. Redaktör MAD. Sevilla-Spanien, sid 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Specialist i laboratorietekniker, galicisk hälsovård (SERGAS). Specifik ämnesagenda volym 2. Redaktionell MAD. Sevilla-Spanien, s. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. (5: e upplagan). Argentina, Redaktion Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiologisk diagnos. 12 utg. Argentina. Redaktionell Panamericana SA