MÜELLER HINTON AGAR: BAS, FÖRBEREDELSE OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den Mueller Hinton-agar inte är selektiv, fast näringsmedium består av köttinfusion, pepton syrakasein, stärkelse, agar och destillerat vatten. Detta medium tillåter utmärkt mikrobiell tillväxt för de flesta snabbväxande bakterier.

Det skapades ursprungligen av John Howard Müeller och Jane Hinton för att isolera näringsriktiga bakterier som Neisseria gonorrhoeae och Neisseria meningitidis. På grund av dess egenskaper visade det sig emellertid vara idealisk för studien av mottaglighet för antibiotika, vilket gav tillförlitliga och reproducerbara resultat.

Antibiogram (Müeller Hinton agar). Källa: Dr Graham Beards på en.wikipedia

Därför är Müeller Hinton agar det kulturmedium som accepteras av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) och Europeiska kommittén för antimikrobiell känslighetstest, för utförandet av det antimikrobiella mottaglighetstestet med Kirby-diskspridningsmetoden och Bauer.

Grund

Som ett icke-selektivt näringsmedium är det utmärkt för tillväxt av de flesta patogena bakterier.

Å andra sidan gör dess enkla sammansättning att ämnena lätt diffunderar på dem och är en väsentlig egenskap för känslighetstestet med skivdiffusionsmetoden.

En annan av dess egenskaper är att den innehåller en låg mängd hämmare, som gör det möjligt att utvärdera sulfonamider, trimetoprim och tetracykliner effektivt.

Man bör emellertid komma ihåg att mediet måste uppfylla vissa villkor för att säkerställa att det fungerar korrekt, inklusive:

Justering av pH, agarns djup och lämplig koncentration av tymin, tymidin, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ och Zn ⁺⁺ .

Du måste också veta att metodiken är standardiserad och att alla parametrar måste uppfyllas, till exempel:

Inokulumets koncentration, koncentration och bevarande av antibiotikaskivor, placering av lämpligt antal skivor på agaren, avståndet mellan en skiva och en annan, den strategiska placeringen av vissa antibiotika, atmosfären, temperaturen och tiden för inkubation.

Förberedelse

Väg ut 37 g dehydratiserat Müeller Hinton-medium och upplös i 1 liter destillerat vatten. Värm mediet under omrörning för att underlätta upplösningen. Koka i 1 minut.

Autoklav för att sterilisera vid 121 ° C i 15 minuter. Vid borttagning från autoklaven ska kolven placeras i ett vattenbad vid 50 ° C för att svalna. Häll 25 till 30 ml i steril petriskål med 10 cm diameter.

Plattorna bör ha en genomsnittlig tjocklek på 4 mm (idealisk), varvid en intervall på 3-5 mm tillåts.

Om det är önskvärt att bereda blodagar med Müeller Hinton-agar som bas, häll 5% sterilt och defibrinerat lammblod innan servering på tallrikarna.

Mediets slutliga pH bör vara mellan 7,2 och 7,4.

Investera och förvara i kylskåp tills användning. Låt plattan komma till rumstemperatur före användning.

Färgen på det beredda mediet är ljusbeige.

tillämpningar

Det används för att utföra antibiogrammet eller antibiotikas mottaglighetstest för de flesta snabbväxande icke-krävande patogener.

Om agaren kompletteras med blod, används den för att utföra antiogrammet av krävande mikroorganismer som: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, bland andra. Det har också använts för att isolera Legionella pneumophila.

Antibiogram teknik

Innan antibiogrammet utförs måste en bakterielösning motsvarande 1,5 x ¹⁰⁸ celler framställas .

För detta tas 3 till 4 kolonier av den rena kulturen och suspenderas i en sojaböntryptikasbuljong eller i Müeller Hinton-buljong, inkuberas under 2 till 6 timmar och koncentrationen justeras med steril saltlösning, jämför den med en Mac Farland-standard av 0,5%.

Om de kräver mikroorganismer kan kolonier suspenderas direkt upp till en koncentration på 0,5% Mac Farland. Därefter ympas Müeller Hinton-plattan med en vattpinne impregnerad med den beredda bakterielösningen.

För att göra detta nedsänks vattpinnen i lösningen och sedan avlägsnas överskottsvätska genom att pressa mot rörets väggar. Omedelbart efteråt passerar vattpinnen över hela ytan, och lämnar inga platser orörda, sedan roteras plattan något och den ympas igen. Operationen upprepas ytterligare två gånger.

Låt stå i 10 minuter och sätt sedan in antibiotikaskivorna med en steril pincett och lämna ett gap på 24 mm mellan dem. Efter att ha placerat varje skiva på agaren trycker du lätt på varje skiva med pincetten för att säkerställa att de fäster bra.

När processen är klar inverteras plattan och inkuberas vid 35-37 ° C i aerobios under 16 till 18 timmar. Om det är en krävande mikroorganism, kan den förtjäna mikroaerofili och om antiogrammet innehåller oxacillinskivor bör det läsas efter 24 timmar.

En linjal används för att mäta diametern på varje halo. Resultaten ska registreras i mm. Därefter korreleras de erhållna värdena med tabellerna över avgränsningspunkter publicerade i den aktuella CLSI-manualen.

Mätning av inhiberingshalogen. Källa: USCDCP, Pixnio.com

Rapportera som känslig (S), mellanliggande (I) eller resistent (R), i förekommande fall.

Antibiotika väljs enligt den isolerade mikroorganismen och typen av infektion som den producerar.

Ibland måste man tänka på den strategiska placeringen av antibiotika för att avslöja fenotypiska resistensmönster.

Strategisk skivplacering på Müeller Hinton agar

För enterobakterier bör clavulansyra-skivan placeras mot 3: e och 4: e generationens cefalosporiner. En äggformad breddning indikerar att stammen är en producent av beta-laktamaser med utökat spektrum (ESBL). Detta innebär att patienten inte ska behandlas med några cefalosporiner.

Fenotypiskt uttryck för utvidgat spektrum beta-laktamas (ESBL) -produktion i en Escherichia coli-stam. Källa: Foto taget av författaren MSc. Marielsa gil

I Staphylococcus är det viktigt att placera erytromycin- eller azitromycin-skivan framför clindamycin-skivan (D-test).

En resistent halo i erytromycin och en utplattning i klindamycinhalogen indikerar att stammen har staminducerbar klindamycinresistens (ICR). Detta betyder att en klindamycinbehandling inte kommer att vara effektiv.

För att söka efter inducerbara AMP C-stammar i Enterobacteriaceae och vissa icke-jäsande Gram-negativa stavar, tazobactan ceftazidim, cefoxitin eller piperacillin-skivor står inför en imipenem-skiva, på ett avstånd av 27 mm.

En planerad gloria i en av skivorna mot imipenem indikerar närvaron av inducerbar AMP C.

För sökningen efter konstitutiv C-AMP står en 500 ug cloxacillinskiva inför ceftazidim (30 ug) och med cefotaxim (30 ug) på ett avstånd av 25 mm. En utvidgad halo i något av cefalosporinerna indikerar positivitet.

Cloxacillinskivan kan också ersättas med en 9 mm skiva av Whatman No. 6-filterpapper impregnerad med fenylborsyra (400 ug) med ett avstånd av 18 mm. Den tolkas på samma sätt som den föregående.

Slutligen, för att undersöka produktionen av metallobetalaktamaser, särskilt i Pseudomonas aeruginosa, används en skiva impregnerad med 10 pl etylendiaminetetraättiksyra (EDTA 750 ug) och tioglykolsyra (SMA 300 ug), som står inför imipenem- och meropenemskivorna, på ett avstånd av 15 mm.

Testet är positivt om det finns en breddning av imipenem- eller meropenem-glosorna mot EDTA / SMA-disken. Detta resultat måste bekräftas med det modifierade Hodge-testet.

Denna metod består av inokulering av en Escherichia coli ATCC 25922-stam på Müeller Hinton-plattan. En imipenem-skiva placeras i mitten av plattan och sedan görs en streck från skivan till periferin med den misstänkta P. aeruginosa-stammen. Upp till 4 stammar kan testas per platta.

Testet kommer att vara positivt om det finns en zon med snedvridning av imipenem-gloria runt sträckmärket.

Orsaker till felaktiga resultat

- Dåligt bevarade antibiotiska skivor kan ge falsk resistens. Till exempel är oxacillindisken mycket sårbar för temperaturförändringar.

-Et pH för mediet under det angivna (sura) producerar mindre halos i aminoglykosider och makrolider (risk för falsk resistens) och större glorier i penicillin, tetracyklin och novobiocin (risk för falsk känslighet).

-Om pH är över det som indikeras (alkaliskt) är effekterna beskrivna ovan vända.

-Media med höga tymin- och tymidinkoncentrationer påverkar genom att signifikant minska hämningshalona för sulfonamider och trimetoprim.

-Höga koncentrationer av kalcium och magnesium ger falsk resistens av aminoglykosider, polymyxin B och tetracykliner mot stammar av Pseudomonas aeruginosa.

-Låga koncentrationer av kalcium och magnesium ger falska känsligheter av aminoglykosider, polymyxin B och tetracykliner mot stammar av Pseudomonas aeruginosa.

- Närvaron av zink påverkar resultaten av karbapenemskivor (imipenem, meropenem och ertapenem).

-Tjockleken för mediet under 3 mm ger falska känslighetsresultat, medan tjockleken över 5 ger falsk resistens.

-Mobiliseringen av skivor i antibiogrammet ger deformerade glorier, eftersom utsläpp av antibiotika är omedelbart.

- Mycket svaga ympningar påverkar resultaten, eftersom det inte kommer att finnas en enhetlig eller sammanflytande tillväxt i agaren, ett nödvändigt skick för att kunna mäta inhiberingshalor, utöver det faktum att glosorna kan ge större än normalt.

-Överladdad inokula kan ge gloror mindre än normalt.

- Att inte respektera avståndet mellan skivor får en halo att överlappa varandra med en annan och de kan inte läsas korrekt.

-Inkubering med CO ₂ ökar storleken på halogen i tetracyklin- och meticillinskivorna.

-Inkubering vid temperaturer under 35 ° C ger större glorier.

-Tillsatsen av blod minskar storleken på sulfa-halogen.

Begränsning

Känsligheten för ett antibiotikum som visas i antikrogrammet mot en mikroorganism (in vitro) är inte en garanti för att det kommer att fungera in vivo.

QA

För att veta om mediet innehåller tillräcklig mängd tymin måste en stam av Enterococcus faecalis ATCC 29212 planteras och känsligheten testas för trimetoprim sulfamethoxazol (SXT), det måste ge en halo lika med eller> 20 mm för att vara tillfredsställande.

referenser

1. "Müller-Hinton agar." Wikipedia, den fria encyklopedin. 16 nov 2018, 12:23 UTC. 27 jan 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Redaktör Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Villkor för en bra känslighetsstudie med agar-diffusionstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hinton agar med 5% fårblod. 2009. Tillgänglig på: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Finns på: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton agar. 2015. Finns på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalaktamaser av AmpC-typ: Allmänheter och metoder för fenotypisk detektion. Pastor Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Finns på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypisk detektion av metallobetalaktamaser i kliniska isolat av Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Finns på: scielo.org.