WRIGHTS FLÄCK: GRUND, MATERIAL, TEKNIK OCH ANVÄNDNINGAR - BIOLOGI - 2025

Den Wright fläcken är en färgningsteknik som skapats av den amerikanska patologen James Homer Wright 1902, baserat på Romanowsky fläcken. Eftersom Romanowsky-fläcken var instabil, införlivade Wright metanol som lösningsmedel och fixativ.

Denna färg är polykromatisk, vilket innebär att den genererar flera färger beroende på strukturen som absorberar färgämnet. Denna färgningsteknik har använts allmänt för att utföra olika vita blodkroppar och för att studera morfologin för röda blodkroppar, blodplättar och leukocyter i perifert blod och benmärg.

Olika perifera blodutstryk färgade med Wrights fläck. A. Akut leukemi B. Plasmodium vivax i erytrocyten. C. Plasmodium falciparum, makrogametocyt. D. Lymfocyt

Dess tillämpning är mycket viktig, eftersom avvikelser kan ses i de olika cellinjerna i blodet, vilket underlättar diagnosen sjukdomar såsom leukemi eller bakteriella eller parasitära infektioner.

Kanske är det de vanligaste applikationerna där den här tekniken används, men de är inte de enda. Det är också användbart i andra prover än blod och benmärg, såsom näsutflöde, fekalt slem, sputum, hudprover, bland andra.

Motivering för Wrights fläck

Wrights fläck föddes från Romanowskys fläck, som består av en metylalkohollösning av ett surt färgämne (eosin Y) och ett basfärgämne (metylenblått) och deras oxidationsprodukter.

Blandningen av färgämnen som används i Wrights fläck orsakar effekten känd som Romanowsky, det vill säga den ger en vacker lila färg till kärnorna i leukocyter och neutrofila granuler, medan de röda blodkropparna färgar rosa.

Komponenterna som är ansvariga för att ge den typiska färgskalan för Wrights fläck är blå B och eosin Y. Effekten som observeras beror på bindningen av färgämnena till kemiska strukturer och interaktioner mellan blå B och eosin Y.

Sura strukturer såsom nukleinsyror, kärnproteiner och reaktiv omogen cytoplasma av vissa celltyper fixar blå B (grundfärg).

Medan basiska strukturer såsom hemoglobin binder granulerna av segmenterade eosinofiler, bland andra cellulära strukturer, eosin Y (sur färgämne).

Färgningsresultatet kan påverkas av olika faktorer, såsom pH för Wright-färgämnet, bufferten och tvättlösningen; samt färgning och fixeringstid.

Därför är varje steg i beredningen av reagensen avgörande och måste genomföras med uppmärksamhet på varje detalj.

material

Wrights fläck. För 100 ml krävs:

Väg ut 0,3 g Wrights fläck, mät 97 ml metanol och 3 ml glycerol.

Förberedelse

I en murbruk placerar du den stora mängden Wrights färgämne och integrerar gradvis glycerolen tills pulvret är helt upplöst.

Därefter tillsättes metanolen, blandas och hälls i en bärnstensflaska.

Före användning bör lösningen skakas med försiktiga rörelser och filtreras.

Buffrad buffertlösning

I en liter destillerat vatten, 3,76 g dinatrium-hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g av diväte kaliumfosfat (KH ₂ PO ₄ ) tillsätts.

Blanda mycket väl tills alla inkorporerade reagens har lösts. Justera pH till 7,2. Häll i en glasburk och hålla i rumstemperatur.

Ytterligare material som behövs för att utföra färgningen

Dessutom krävs andra material för att kunna utföra färgningstekniken, dessa är: objekt glider eller täcker föremål, målarbro, t-shirts med vatten eller buffert för tvätt, en timer för att hålla färgtiderna och lite torkmaterial (absorberande papper, gasbind eller bomull).

Komponenter i Wrights fläck

metanol

Alkohol (metanol) fungerar som ett fixativ för blodsmetningen till glidbanan.

Det är i grunden ett koaguleringsmedel som reducerar, dehydratiserar och fixerar reagens. Därför är dess funktion att koagulera proteiner och göra dem olösliga, men utan att denaturera dem faktiskt.

Metanol är det mest använda smetfixeringsreagenset i alla laboratorier, eftersom det ger bättre resultat än etanol. Den ideala koncentrationen är 99%.

Spjäll

Bufferten (buffrad lösning) har funktionen att justera eller bibehålla färgämnets pH, eftersom ett pH justerat till 7,2 är väsentligt för att cellstrukturerna ska kunna absorbera färgämnen ordentligt.

Å andra sidan dehydratiserar metanolfixeringssteget cellerna och bufferten hjälper till att rehydrera dem.

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet för byggstenar eftersom det är ett surt färgämne. Två typer av eosin är kända mycket lika varandra, så mycket att någon av de två kan användas, vilket ger samma resultat.

Den ena kallas eosin Y, gult eosin eller tetrabromofluorescein, och det andra kallas eosin B, blått erytrosin B eller dibromodinitrofluorescein. Emellertid är eosin Y det vanligaste.

Den viktigaste egenskapen hos detta färgämne är dess negativa polaritet, vilket gör att det lockas till positivt laddade cellstrukturer.

Metylenblå

Det är den grundläggande färgningen. Dess huvudegenskap är metachromasia, det vill säga inte alla strukturer kommer att färgas i samma färg, det beror på den kemiska sammansättningen av de strukturer som färgas.

Vissa blir ljusa eller mörkblåa, och andra blir mörklila eller blek lila.

Metod

1-Utför spridningen av provet så att en tunn film kvarstår, antingen på en bild eller täckglas.

2-Låt den torka i luften i cirka 2 timmar.

3-Placera torrutstrykningen på färgningsbryggan eller färgbrickan med provets spridning uppåt.

4-täcka arket med Wright-fläcken droppe för droppe tills hela ytan är täckt. Låt stå i 5 - 8 minuter.

5-Fläcken ska täcka objektglaset helt utan att det spills över kanterna. Om det börjar förångas under färgtiden, tillsätt några droppar till.

6 - Tillsätt därefter en lika stor mängd stötdämpare, blåsa lite tills den karakteristiska metalliska glansen visas. Tid 10 till 15 minuter.

7-Tvätta med kranvatten, placera den milda strömmen tills lakan ser rosa ut.

8-Ta bort färgämnet som klistras fast på baksidan av sliden med en gas i blöt i alkohol.

9-Låt utstrykningen torka mycket väl innan du placerar nedsänkningsoljan för att se den under mikroskopet.

Verktyg

Hematology

Det är idealiskt för färgning av perifera blodutstryk, för undersökning av tjocka blodfläckar och för studier av celler från benmärgsprover.

På grund av de kemiska egenskaperna hos denna kombination av färgämnen kan cellstrukturer lätt identifieras och de olika typerna av celler som finns närvarande kan särskiljas.

Rinnande näsa

Denna teknik är mycket användbar för att identifiera cellerna från näsutflödet (epitelceller, segmenterade eosinofiler, polymorfonukleära celler) vid diagnosen allergisk rinit.

parasitologi

I detta avseende har det varit användbart för studien av Leishmania sp inom histiocyterna i den subkutana cellvävnaden i hudsår. På samma sätt används det för att identifiera leukocyter i avföringsprover (fekal leukogram).

I detta fall är det av intresse för läkaren att veta om leukocytos som finns i avföringen är polymorfonukleär eller mononukleär. Denna upptäckt i fekal leukogram kommer att leda om det är en bakteriell respektive virusinfektion.

Å andra sidan kan parasiter som cirkulerar i blodet hittas i erytrocyten eller fria i plasma. De parasiter som söks är Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii och filarias, och inom veterinärmedicin är det användbart i sökandet efter Theileria equi och Babesia caballi, orsakssubstanser för bebesios, särskilt hos hästar.

Wright-fläcken och även Giemsa-fläcken gör det möjligt att skilja hemoparasiter från normala cellkomponenter. Två typer av uppslag kan användas för detta:

Sprid tunt

Blod sprids som en tunn film på en bild. Den är färgad med Wrights fläck, vilket avslöjar egenskaperna hos kärnan och cytoplasma.

Tjock droppe

Denna metod används för att undersöka förekomsten av parasiter i en större mängd blod.

För att göra detta placeras en stor droppe blod på en bild. När den är där måste den defibrilleras, göra större och större cirklar från mitten utåt med kanten på en annan bild.

Slutligen måste erytrocyterna lysas med vatten för att kunna observera parasiterna i den tjocka utstrykningen.

Luftvägsinfektioner

På andningsnivå är denna teknik också användbar, eftersom cellerna som finns i proverna av sputum, bronkial lavage eller bronchoalveolar, är viktiga för att fastställa diagnosen.

På liknande sätt kan polymorfonukleära celler och mononukleära celler här särskiljas.

Bakteriologi

Användningen av denna teknik i bakteriologi är begränsad, eftersom den inte är bra för färgning av bakterier, varför andra specialiserade färgningstekniker används för deras färgning.

Det har emellertid använts för att söka efter epitelceller med Chlamydia trachomatis inklusionskroppar i urinrörs- eller endocervikala slemhinnor, även om det måste inses att det inte är den bästa metoden för detta.

Det är också möjligt att observera spiralliknande bakterier som Borrelia burgdorferi bland röda blodkroppar hos infekterade patienter, liksom morulaer eller inklusionskroppar av Ehrlichia sp i cytoplasma av lymfocyter, monocyter eller neutrofiler i en blodsmetning.

Mykologi

Histoplasma capsulatum är en patogen svamp som ofta diagnostiseras genom mikroskopisk observation av olika vävnadsprover, färgade med Wrights fläck.

Hur observeras strukturerna i blodprovet med Wrights fläck?

Källa: Retamales E, Mazo V. Institutet för folkhälsa, Chiles regering. Rekommendationer för färgning av blodutstryk för läsning av hemogrammet.

Rekommendationer för god färgning

Blodprovskivorna bör lufttorka spontant. Utseende bör vara så tunn som möjligt för att få bättre fixering av färgämnet och undvika överfärgning.

För färgning av hög kvalitet rekommenderas det att färgas inom två timmar efter att smörjpreparat har gjorts. Å andra sidan är det ideala provet kapillärt blod, utan antikoagulant.

Men om venöst blod används bör det användas som antikoagulant EDTA och inte heparin, eftersom det senare kan deformera cellstrukturer.

För att undvika försämring av den beredda färgen bör den förvaras på torra platser.

Under tvättprocessen rekommenderas användning av vatten justerat till ett neutralt pH.

Slutligen är det tillrådligt att testa de färgningsmetoder som används i laboratoriet då och då.

Detta görs genom färgning av prover eller utökade mönster som en kvalitetskontroll. Detta steg är viktigt eftersom det säkerställer att färgningen är korrekt förberedd och färgningstiderna är väl standardiserade.

Om mönsterarket är dåligt färgat, finns det problem som måste lösas.

Vanliga misstag vid Wright-färgning

Mycket blek färgning

Mycket bleka utstryk beror vanligtvis på mycket kort färgningstid eller överdriven tvätt. Det korrigeras genom att förlänga kontakttiden med färgämnet eller minska tvättiden.

Färgämne fälls ut

Närvaron av fällningar av färgämnen i smet kan ha flera orsaker, men de vanligaste orsakerna är: användning av ofiltrerat färgämne, färgning på ojämna färgningsbroar, användning av ark som är smutsiga med damm eller fett, inte tvätta väl fullständig färgning.

Extremt rött eller blått utstryk

Bufferten är ansvarig för färgämnets pH. Färgämnen med ett pH-värde under det indikerade (sura) kommer att resultera i mycket rödaktiga utstryk.

Om färgämnets pH är över (alkaliskt) erhålls ett extremt blåaktig utstryk.

Lagringsläge

Reagenset ska förvaras vid rumstemperatur.

referenser

1. Gutiérrez V. Jämförande studie mellan Wright-färgningsmetoden och Elisa-testet för diagnos av hund Ehrlichiosis i staden San Pedro Sula, Honduras. 2008. Examensarbete för att kvalificera sig till veterinärmedicinsk examen. San Carlos universitet i Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grundfläckar i mikrobiologilaboratoriet. Forskning om funktionshinder. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wrights fläck." Wikipedia, den fria encyklopedin. 18 maj 2018, 12:05 UTC. 8 dec 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frees of Babesia spp. på jakthästar, Córdoba (Colombia). Pastor udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Argentina. Redaktionell Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institutet för Chile för folkhälsoregering. Rekommendationer för färgning av blodutstryk för läsning av hemogrammet.