IMMUNFLUORESCENS: SKÄL, PROTOKOLL OCH APPLIKATIONER - BIOLOGI - 2025

Den immunofluorescens är en kraftfull teknik immunfärgning med användning av antikroppar som är kovalent bundna till fluorescerande molekyler för att identifiera specifika mål i cellprover fixerade på en fast bärare.

Denna teknik involverar mikroskopisk observation med immunologisk specificitet, vilket gör det möjligt att observera levande eller döda celler som kan uppvisa små mängder antigener. Det används allmänt både inom forskningsområdet och vid klinisk diagnos av olika patologier.

Immunolabeling av aktinfilament i kardiomyocytceller (Källa: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Denna teknik, främst kvalitativ (med vissa kvantitativa varianter), har specifikt att göra med visualiseringen av ett prov med produktsignalen från en fluorofor, som är en fluorescerande molekyl bunden till en antikropp och som kan exciteras vid en viss våglängd .

I cellulärt sammanhang är det mycket användbart att studera närvaro / frånvaro och subcellulär placering av proteiner. Tekniken användes initialt i den kliniska miljön för diagnos av virus såsom influensa och därefter för många andra infektionssjukdomar.

Det är en mycket känslig teknik och med lämplig mikroskopiutrustning kan den ha mycket bra upplösning. Det kräver, för dess observation, användning av konfokala eller epifluorescensmikroskop.

Trots att det är väldigt populärt kan det emellertid ge några viktiga problem när det gäller att få ospecifik fluorescens som genererar viss bakgrundsljud, vilket ofta begränsar tillräcklig avläsning av resultaten.

Grund

Immunfluorescens är baserat på utnyttjandet av det biologiska fenomenet i interaktionsreaktionen mellan en antikropp och ett antigen. Det har specifikt att göra med visualisering eller detektering av denna reaktion med spännande fluorescerande molekyler till en specifik våglängd.

En antikropp är ett immunglobulinprotein som utsöndras från aktiva B-celler, som specifikt genereras mot ett antigen, till vilket det kan binda med stor affinitet och specificitet. Immunfluorescens använder sig av IgG-immunglobuliner, som finns lösliga i blodserum.

Antikroppar är molekyler upp till 950 kDa som består av två korta (lätta) och två långa "Y" -formade (tunga) peptidkedjor. Både de lätta och tunga kedjorna är indelade i två domäner: en variabel, som kan känna igen antigenet, och den andra konstant eller bevarad, karakteristisk för varje art.

Antigener definieras funktionellt som molekyler som kan identifieras av en antikropp och är till största delen proteiner. När ett djur exponeras för ett antigen aktiveras immunsystemets lymfocyter, vilket ger specifika antikroppar mot det och som fungerar som ett försvarssystem.

Ett antigen, såsom ett protein, till exempel, kan ha mer än en epitop eller plats för igenkänning av en antikropp, varför serumet från djuret exponerat för ett antigen kan ha polyklonala antikroppar mot olika regioner av samma protein.

Immunfluorescens utnyttjar då ett djur förmåga att producera polyklonala antikroppar mot ett specifikt antigen för att rena det och därefter använda det för detektering av samma antigen i andra sammanhang.

Bland fluorescerande färgämnen eller molekyler som mest används för vissa immunofluorescensmetoder är fluoresceinisotiocyanat (FITC), tetrametylrhodaminisotiocyanat-5 och 6 (TRITC), många cyaniner som Cy2, Cy3, Cy5 och Cy7 och färgämnen kallad Alexa Fluor® , såsom Alexa Fluor®448.

Protokoll

Immunfluorescensprotokollet varierar beroende på många faktorer, men i allmänna termer omfattar det en linjär sekvens av steg bestående av:

• Beredning av plattorna och cellerna
• Fixering av prover
• permeabilization
• Blockering
• Immunfarvning eller immunsärande
• Montering och observation

-Förberedelse

Av proverna

Beredningen av proverna beror på deras art och vilken typ av erfarenhet som ska utföras. Det enklaste fallet, som involverar användning av celler i suspension, kommer att förklaras nedan.

Celler i suspension, det vill säga i ett flytande odlingsmedium, måste först separeras från det genom centrifugering och sedan måste tvättas med en buffertlösning eller en isosmotisk "buffert", vilket bevarar deras integritet.

Normalt används en fosfat-saltbuffert, känd som PBS, i vilken cellerna återuppslammas och denna blandning centrifugeras igen för att erhålla cellerna fria från odlingsmediet, som kan innehålla störande ämnen.

Av bladen

Objektglas som används för mikroskopisk observation, där cellerna senare kommer att fixeras för motsvarande nedströmsbehandlingar, måste också förberedas noggrant.

Dessa täcks eller "sensibiliseras" med en lösning av poly-lysin, en syntetisk polymer som kommer att fungera som ett "molekylärt lim" mellan cellerna och det fasta underlaget, tack vare den elektrostatiska växelverkan mellan de positiva laddningarna för deras aminogrupper och negativa laddningar på proteinerna som täcker celler.

Fixering av prover

Denna process består av att immobilisera de proteiner som finns i cellen för att hålla deras rumsliga plats intakt. De använda molekylerna måste kunna korsa alla typer av cellmembran och bilda gitter med kovalenta proteiner.

Formaldehyd och paraformaldehyd, glutaraldehyd och till och med metanol används i stor utsträckning, med vilka cellprover inkuberas under en viss tid och tvättas sedan med en isosmotisk buffertlösning.

Efter fixering av cellerna fortsätter de att fästas på arken som tidigare sensibiliserats med poly-lysin.

permeabilization

Beroende på vilken typ av test som utförs kommer det att vara nödvändigt att permeabilisera cellerna som studeras eller inte. Om det som söks är att känna till platsen, närvaron eller frånvaron av ett visst protein på cellytan, kommer permeabilisering inte att behövas.

Å andra sidan, om du vill veta platsen för ett protein i cellen, är permeabilisering väsentlig och kommer att bestå av att inkubera proverna med Triton X-100, ett tvättmedel som kan permeabilisera cellmembran.

Blockering

Ett grundläggande steg i alla immunologiska tekniker är att blockera. I detta skede av proceduren består blockering av att på de sensibiliserade arken täcka alla ställen med poly-lysinmolekyler till vilka celler inte fästs. Det vill säga, det förhindrar någon ospecifik union.

Normalt används lösningar med bovint serumalbumin (BSA) i PBS-buffert för att blockera och de bästa resultaten erhålls desto längre inkubationstid med denna lösning. Efter varje steg, inklusive blockering, är det nödvändigt att tvätta bort den återstående lösningen.

Immunfarvning eller immunsärande

Immunfärgnings- eller immunfärgningsförfarandet beror huvudsakligen på om det är en direkt eller indirekt immunofluorescens (se nedan).

Om det är en primär eller direkt immunofluorescens, inkuberas proverna med de önskade antikropparna, som måste kopplas till de fluorescerande färgämnena. Inkubationsförfarandet består av att göra en utspädning av antikroppen i en lösning som också kommer att innehålla BSA men i en lägre andel.

När fallet är det med en sekundär eller indirekt immunofluorescens, bör två på varandra följande inkubationer utföras. Först med de önskade antikropparna och sedan med antikropparna som kan detektera de konstanta regionerna hos de primära immunoglobulinerna. Det är dessa sekundära antikroppar som är kovalent bundna till fluoroforer.

Tekniken är mycket mångsidig, vilket möjliggör samtidig märkning av mer än ett antigen per prov, så länge det finns primära antikroppar kopplade till olika fluoroforer, i fallet med direkt immunofluorescens.

För samtidig märkning vid indirekt immunofluorescens är det nödvändigt att säkerställa att varje primär antikropp produceras i ett annat djur, liksom att varje sekundär antikropp kopplas till en annan fluorofor.

Precis som blockering ger inkubation med antikroppar bättre resultat ju längre tid det här är. Efter varje steg är det nödvändigt att tvätta bort överskottet av antikroppar som inte binds till proverna och i den sekundära immunofluorescensen är det nödvändigt att blockera innan den sekundära antikroppen tillsätts.

Vissa tekniker använder andra fläckar som inte är relaterade till immunfärgning, såsom färgning av kärn-DNA med DAPI-fluoroforen.

Montering och observation

Under den sista inkubationstiden med fluoroforerna är det nödvändigt att proverna förblir i mörkret. För observation under mikroskopet är det vanligt att använda vissa ämnen för att bevara fluorescensen hos fluoroforerna kopplade till antikropparna.

typer

Grafisk sammanfattning av direkt och indirekt immunofluorescens (Källa: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Direkt eller primär immunfluorescens

Det har att göra med detektering av antigen genom användning av fluorescerande antikroppar. Den huvudsakliga fördelen med att använda denna teknik är dess hastighet, men många fall av icke-specifik bindning kan inträffa i processen, särskilt när man studerar humana sera, eftersom de är rika på mycket heterogena antikroppar.

Indirekt eller sekundär immunofluorescens

Det är också känt som "sandwich" -tekniken och detta involverar utvecklingen av tekniken i två steg. Det första har att göra med användningen av en icke-fluorescerande antikropp och dess bindning till antigenet av intresse.

Mot den konstanta regionen av denna första antikropp (som nu kommer att fungera som antigen) används en andra antikropp med förmåga att känna igen den, vilken är associerad med en fluorescerande molekyl.

Utseendet på en fluorescerande signal kommer att vara resultatet av specifikt igenkänning mellan den första icke-fluorescerande antikroppen och antigenet av intresse; närvaron av denna första antikropp betingar den för den andra, som är märkt och tack vare vilken antigenets närvaro eller frånvaro kan bestämmas.

Trots att det är en mycket mer tidskrävande teknik än direkt immunofluorescens (eftersom den inkluderar ytterligare ett inkubationssteg) involverar denna teknik inte utformningen av en fluorescerande antikropp för varje antigen som studeras, vilket resulterar i ekonomiska termer, mer livskraftig.

Vidare är det en mer känslig teknik när det gäller signalamplifiering, eftersom mer än en sekundär antikropp kan binda till den konstanta regionen för den primära antikroppen, vilket således förstärker fluorescerande signalens intensitet.

tillämpningar

Som tidigare har noterats är immunfluorescens en extremt mångsidig teknik som har använts på många sätt inom det vetenskapliga och kliniska området. Det kan användas för att besvara ekologiska, genetiska och fysiologiska frågor angående många organismer.

Bland de kliniska tillämpningarna används den för direkt diagnos av vissa dermatologiska sjukdomar, antingen med användning av direkt eller indirekt immunofluorescens på epitelvävnad hos de studerade patienterna.

Immunofluorescens-tekniker har varit tillgängliga i encelliga organismer såsom jäst för att visualisera intranukleära och cytoplasmiska mikrotubuli, aktin och tillhörande proteiner, 10 nm filament och andra beståndsdelar i cytoplasma, membran och cellväggar.

referenser

1. Abcam, immunocytokemi och immunofluorescensprotokoll. Hämtad från abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescerande färgämnen. Hämtad från leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluorescensmikroskopi. I Methods in Cell Biology (Vol. 48, s. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Immunofluorescens tekniker. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Immunofluorescensmetoder för jäst. I Methods of Enzymology (Vol. 194, s. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Tillämpningar av immunfluorescens i folkhälsovirologi. Bacteriologic Reviews, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Immunfluorescens i fytoplanktonforskning: tillämpningar och potential. J: Phycol. , 32, 1–16.