RESTRIKTIONSENZYMER: FUNKTIONER, TYPER OCH EXEMPEL - BIOLOGI

De restriktionsenzymer är endonukleaser som används av vissa arkebakterier och bakterier att hämma eller "begränsa" spridning av virus inuti. De är särskilt vanliga i bakterier och ingår i deras försvarssystem mot främmande DNA, känt som restriktions- / modifieringssystemet.

Dessa enzymer katalyserar klyvningen av dubbelband-DNA på specifika platser, reproducerbart och utan användning av ytterligare energi. De flesta kräver närvaro av kofaktorer såsom magnesium eller andra tvåvärda katjoner, även om vissa också kräver ATP eller S-adenosylmetionin.

HindIII-restriktionsenzymreaktionsschema (Källa: Helixitta via Wikimedia Commons)

Endonukleaser för restriktioner upptäcktes 1978 av Daniel Nathans, Arber Werner och Hamilton Smith, som fick Nobelpriset i medicin för sin upptäckt. Deras namn kommer vanligtvis från organismen där de först observerades.

Sådana enzymer används ofta i utvecklingen av DNA-kloningsmetoder och andra molekylärbiologiska och gentekniska strategier. Deras specifika sekvensigenkänningsegenskaper och förmågan att klippa sekvenser nära igenkänningsplatser gör dem till kraftfulla verktyg i genetisk experiment.

Fragment genererade av restriktionsenzymer som har verkat på en viss DNA-molekyl kan användas för att återskapa en "karta" av den ursprungliga molekylen genom att använda information om platserna där enzymet skär DNA.

Vissa restriktionsenzymer kan ha samma igenkänningsplats på DNA, men de skär inte nödvändigtvis det på samma sätt. Således finns det enzymer som skär ut och lämnar trubbiga ändar och enzymer som skär skärande sammanhängande ändar, som har olika tillämpningar inom molekylärbiologi.

För närvarande finns det hundratals olika kommersiellt tillgängliga restriktionsenzymer, som erbjuds av olika kommersiella hus; Dessa enzymer fungerar som "anpassade" molekylsaxar för olika ändamål.

Funktioner

Restriktionsenzymer uppfyller den motsatta funktionen av polymeraser, eftersom de hydrolyserar eller bryter esterbindningen inom fosfodiesterbindningen mellan intilliggande nukleotider i en nukleotidkedja.

Inom molekylärbiologi och genteknik används de allmänt använda verktyg för konstruktion av expressions- och kloningsvektorer, såväl som för identifiering av specifika sekvenser. De är också användbara för konstruktion av rekombinanta genom och har stor bioteknologisk potential.

De senaste framstegen inom genterapi utnyttjar nuvarande restriktionsenzymer för införande av speciella gener i vektorer som är fordon för transport av sådana gener till levande celler, och som troligen har förmågan att införa i cellgenomet för att utföra permanenta förändringar.

Handlingsmekanism

Restriktionsenzymer kan katalysera dubbelbands-DNA-klyvning, även om vissa är i stånd att känna igen enkelbands-DNA-sekvenser och till och med RNA. Klippning sker efter igenkänning av sekvenserna.

Verkningsmekanismen består av hydrolys av fosfodiesterbindningen mellan en fosfatgrupp och en deoxiribos i skelettet hos varje DNA-sträng. Många av enzymerna kan skäras på samma ställe som de känner igen, medan andra skär mellan 5 och 9 baspar före eller efter det.

Normalt skär dessa enzymer vid 5'-änden av fosfatgruppen, vilket ger upphov till DNA-fragment med en 5'-fosforylände och en 3'-terminal hydroxylände.

Eftersom proteiner inte kommer i direkt kontakt med igenkänningsstället i DNA, måste de omvandlas successivt tills det specifika stället uppnås, kanske med hjälp av "glidande" mekanismer på DNA-strängen.

Under enzymatisk klyvning placeras fosfodiesterbindningen i var och en av DNA-strängarna inom ett av de aktiva ställena för restriktionsenzymer. När enzymet lämnar igenkännings- och klyvningsstället gör det genom icke-specifika kortvariga föreningar.

typer

Fem typer av restriktionsenzymer är för närvarande kända. Här är en kort beskrivning av var och en:

Typ I-restriktionsenzymer

Dessa enzymer är stora pentamerproteiner med tre underenheter, en för restriktion, en för metylering och en för sekvensigenkänning i DNA. Dessa endonukleaser är multifunktionella proteiner som kan katalysera restriktions- och modifieringsreaktioner, de har ATPas-aktivitet och även DNA-topoisomeras.

Enzymer av denna typ var de första endonukleaserna som upptäcktes, de renades först på 1960-talet och har studerats i stort djup sedan dess.

Typ I-enzymer används inte i stor utsträckning som ett bioteknologiskt verktyg, eftersom klyvningsstället kan ligga på ett varierande avstånd på upp till 1 000 baspar från igenkänningsstället, vilket gör dem opålitliga när det gäller experimentell reproducerbarhet.

Typ II-restriktionsenzymer

De är enzymer som består av homodimerer eller tetramerer som skär DNA på definierade ställen mellan 4 och 8 bp i längd. Dessa klyvningsställen är typiskt palindromiska, det vill säga de känner igen sekvenser som läses på samma sätt i båda riktningarna.

Många av typ II-restriktionsenzymer i bakterier skär DNA när de känner igen dess främmande karaktär, eftersom det inte har de typiska modifieringarna som dess eget DNA bör ha.

Dessa är de enklaste restriktionsenzymerna eftersom de inte kräver någon annan kofaktor än magnesium (Mg +) för att känna igen och skära DNA-sekvenser.

Precisionen för restriktionsenzymer av typ II vid igenkänning och skärning av enkla sekvenser i DNA vid exakta positioner gör dem till de mest använda och oumbärliga i de flesta grenar av molekylärbiologi.

Inom gruppen av typ II-restriktionsenzymer finns det flera underklasser klassificerade enligt vissa egenskaper som är unika för var och en. Klassificeringen av dessa enzymer görs genom att lägga till bokstäver i alfabetet, från A till Z efter namnet på enzymet.

Några av de underklasser som är mest kända för sin användbarhet är:

Underklass IIA

De är dimerer av olika underenheter. De känner igen asymmetriska sekvenser och används som ideala föregångare för generering av skärande enzymer.

Underklass IIB

De består av en eller flera dimerer och skär DNA på båda sidor av igenkänningssekvensen. De skär båda DNA-strängarna ett basparintervall före igenkänningsstället.

Underklass IIC

Enzymer av denna typ är polypeptider med funktioner för uppdelning och modifiering av DNA-strängar. Dessa enzymer skär båda strängarna asymmetriskt.

Underklass IIE

Enzymerna i denna underklass är de mest använda inom genteknik. De har ett katalytiskt ställe och kräver generellt en allosterisk effektor. Dessa enzymer måste interagera med två kopior av deras igenkänningssekvens för att utföra effektiv klyvning. Inom denna underklass ingår enzymerna EcoRII och EcoRI.

Typ III-restriktionsenzymer

Endonukleaser av typ III-restriktion består av endast två underenheter, en är ansvarig för DNA-igenkänning och modifiering, medan den andra ansvarar för sekvensspjälkning.

Dessa enzymer kräver två kofaktorer för deras funktion: ATP och magnesium. Restriktionsenzymer av denna typ har två asymmetriska igenkänningsställen, translokerar DNA på ett ATP-beroende sätt och skär det mellan 20-30 bp intill igenkänningsstället.

Typ IV-restriktionsenzymer

Typ IV-enzymer är lätta att identifiera när de skär DNA med metyleringsmärken, de består av flera olika underenheter som ansvarar för igenkänning och skärning av DNA-sekvensen. Dessa enzymer använder GTP och divalent magnesium som kofaktorer.

Specifika klyvningsställen inkluderar nukleotidsträngar med metylerade eller hydroximetylerade cytosinrester på en eller båda strängarna av nukleinsyror.

Typ V-restriktionsenzymer

Denna klassificering grupperar CRISPER-Cas-enzymerna, som identifierar och skär specifika DNA-sekvenser från invaderande organismer. Cas-enzymer använder en sträng av CRISPER-syntetiserad guide-RNA för att känna igen och attackera invaderande organismer.

Enzymer klassificerade som typ V är polypeptider strukturerade av enzym av typ I, II och II. De kan klippa delar av DNA från nästan vilken som helst organisme och med ett brett längdintervall. Deras flexibilitet och användarvänlighet gör dessa enzymer till ett av de mest använda verktygen inom genteknik idag, tillsammans med typ II-enzymer.

exempel

Restriktionsenzymer har använts för att detektera DNA-polymorfismer, speciellt i populationsgenetiska studier och evolutionära studier med användning av mitokondriell DNA, för att få information om graden av nukleotidsubstitutioner.

För närvarande har vektorerna som används för transformation av bakterier för olika ändamål multikloningsställen där igenkänningsställen för flera restriktionsenzymer finns.

Bland dessa enzymer är de mest populära EcoRI, II, III, IV och V, erhållna och beskrivna för första gången från E. coli; HindIII från H. influenzae och BamHI från B. amyloliquefaciens.

referenser

Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologi för DNA-begränsning. Mikrobiologiska recensioner, 57 (2), 434–450.
Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR Ger förvärvad resistens mot virus i prokaryoter. Science, 315 (mars), 1709–1713.
Goodsell, D. (2002). Det molekylära perspektivet: Begränsning av endonukleaser. Stamceller Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191.
Halford, SE (2001). Hoppning, hoppning och looping av restriktionsenzymer. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
Jeltsch, A. (2003). Underhåll av artens identitet och kontroll av bakteriespeciering: en ny funktion för system för restriktion / modifiering? Gen, 317, 13-16.
Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins Gen XII (12 red.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … She, Q. (2015). Utnyttja typ I och Type III CRISPR-Cas-system för genomredigering. Nucleic Acids Research, 1–12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Typ I-restriktionsenzymer och deras släktingar. Nucleic Acids Research, 1–25.
Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktion Endonukleaser vid analys och omstrukturering av DNA-molekyler. Annu. Pastor Biochem. , 273–293.
Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna-polymorfism detekterbar genom restriktionsendonukleaser. Genetik, 145-163.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Typ II-restriktionsendonukleaser: struktur och mekanism. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
Roberts, R. (2005). Hur restriktionsenzymer blev arbetshästar inom molekylärbiologi. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Begränsning av endonukleaser. Kritiska recensioner i biokemi, (november), 123-164.
Stoddard, BL (2005). Inhemsk endonukleasstruktur och funktion. Kvartalsöversikter av biofysik, 1–47.
Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologin för restriktion och anti-restriktion. Aktuellt yttrande i mikrobiologi, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
Wilson, GG, & Murray, NE (1991). System för begränsning och modifiering. Annu. Pastor Genet. 25, 585-627.
Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisk insikt i Campylobacter jejuni virulens och befolkningsgenetik. Infec. Dis. Övers. Med., 2 (3), 109–119.
Yuan, R. (1981). Struktur och mekanism för multifunktionella restriktionsendonukleaser. Annu. Pastor Biochem. 50, 285-315.

RESTRIKTIONSENZYMER: FUNKTIONER, TYPER OCH EXEMPEL - BIOLOGI - 2025