GRAMFÄRG: SKÄL, MATERIAL, TEKNIK OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDEN - BIOLOGI - 2025

Den gramfärgning är den enklaste och mest användbara färgningsteknik Denna teknik skapades av den danska doktorn Hans Christian Gram 1884, som lyckades klassificera bakterier som Gram-positiva och Gram-negativa, enligt cellväggens sammansättning.

Tekniken genomgick vissa modifieringar av Hucker 1921 för att stabilisera reagensen och förbättra kvaliteten på färgningen, varför Gram-fläcken också kallas Gram-Hucker.

Olika utstryk färgade med Gram-fläck. A. Gram positiva cocci. B. Gram negativa stavar. C. Grampositiva, polymorfonukleära och mononukleära baciller. D. Jäst.

Med denna teknik är det också möjligt att observera formen på mikroorganismerna, det vill säga om de är cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorf, filamentös, bland andra. Förutom dess fördelning i rymden: i ett kluster, i en kedja, isolerat, i par, i tetrader osv.

När man misstänker en bakteriell infektion bör de flesta av de mottagna proverna smutsas på en bild och Gram färgas för mikroskopisk undersökning.

Gram-rapporten kommer att vägleda läkaren om vilken typ av mikroorganism som kan vara orsaken till infektionen innan det slutliga kulturresultatet erhålls.

I vissa fall är patientens liv mycket kompromissa, därför behöver läkare snabbt Gram-rapporten för att utföra en empirisk behandling, medan de väntar på att identifiera mikroorganismen.

Till exempel, om Gram avslöjar att det finns Gram-positiva kockor i cerebrospinalvätskan, kommer läkaren att vägleda den initiala behandlingen med antibiotika som eliminerar denna typ av bakterier, enligt de protokoll som fastställts för detta.

När det slutliga resultatet har kommit med namnet på den isolerade mikroorganismen och dess respektive antibiogram, kommer läkaren att utvärdera om hanteringen ska ändras eller inte. Detta beslut kommer att fattas enligt studien om mikroorganismens mottaglighet för antibiotika som han får och patientens utveckling.

Grund

Detta är en teknik som har fyra grundläggande steg: färgning, fixering med mordanten, missfärgning och försänkning. Därför tillåter denna teknik förutom att färga bakterierna också differentierade.

Crystal violet är den första färgämnet som används. Den har en affinitet för peptidoglykan och kommer att färga alla bakterier som är närvarande lila, därefter placeras lugolen, som fungerar som en mordant, det vill säga att den kommer att inducera bildningen av olösliga kristallviolett jodkomplex - ribonukleära proteiner i cellen. .

Grampositiva bakterier, som har en tjock vägg av peptidoglykan, bildar fler komplex (kristallviolett jod), därför behåller de färgämnet.

Dessutom påverkar det också att väggen hos Gram-positiva bakterier innehåller en större mängd omättade syror, som visar stor affinitet för oxidationsmedel (Lugol).

Samtidigt har gramnegativa bakterier ett tunt lager peptidoglykan, vilket gör att bakterierna bildar mindre komplex än Gram-positiva.

Sedan kommer missfärgningssteget, där Gram-positiva och Gram-negativa bakterier beter sig annorlunda.

Gramnegativa bakterier innehåller ett yttre membran som är rikt på lipopolysackarider som är en del av deras cellvägg. Fetter förstörs genom kontakt med acetonalkohol, så det yttre membranet blir destabiliserat och släpper den violetta kristallen.

Så motverkas det sedan med safranin eller basisk fuchsin och blir röd.

När det gäller Gram-positiva bakterier motstår de blekning eftersom blekmedlet fungerar genom att stänga porerna och förhindra att kristallviolet / jodkomplexet läcker ut.

Därför förblir färgningen med kristallviolett stabil, och det finns inget utrymme för safranin eller fuchsin. Det är därför dessa bakterier färgar djupblått eller lila.

material

Grams färgningssats består av:

• Violett glas
• Lugols
• Acetonalkohol
• Safranin eller basisk fuchsin

Beredning av färgämnen och reagens

Kristallviolett lösning

Lösning till:

Violett kristall ------------- 2 gr

Etylalkohol 95% ----------- 20cc

Lösning B:

Ammoniumoxalat ----------- 0,8 gr

Destillerat vatten ------------- 80 cc

För den slutliga beredningen av kristallviolett måste lösning A spädas 1:10 med destillerat vatten och blandas med 4 delar lösning B. Blandningen förvaras i 24 timmar före användning. Filtrera i en bärnstensfärgad flaska med filterpapper.

Mängden som ska användas dagligen överförs till en bärnstensfärgad flaska.

Jod-Lugols

Väg och mät den angivna mängden av varje förening enligt följande:

Jodkristaller ------------- 1gr

Kaliumjodid ------------- 2gr

Destillerat vatten ------------- 300 cc

Kaliumjodid upplöses lite i vattnet och därefter tillsätts jod. Lösningen rakas i en bärnstensflaska.

Mängden som ska användas dagligen överförs till en mindre bärnstensflaska med en dropper.

Blekning

95% etylalkohol ----------- 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Det förbereds i lika delar. Täck väl, eftersom det tenderar att förångas.

Placera i en droppflaska.

Denna beredning ger en missfärgning i måttlig tid 5-10 sekunder och är den mest rekommenderade.

Nybörjare föredrar att endast använda 95% etylalkohol, där blekning är långsammare än 10 till 30 sekunder.

Medan de mer erfarna kan använda ren aceton, där missfärgning sker mycket snabbt från 1 till 5 sekunder.

Kontrast

Safranin lagerlösning

Safranina -------------– 2,5 gr

Etylalkohol 95% --------– 100 cc

Efter vägning av den angivna mängden safranin löses den i 100 ml 95% etylalkohol.

Den fungerande safraninlösningen framställs från stamlösningen.

För att göra detta, mät 10 cm av stamlösningen, tillsätt 90 cm destillerat vatten för att göra 100 ml.

Det rekommenderas att överföra mängden som ska användas dagligen till en bärnstensflaska med en dropper.

Mikroorganismer som färgar svagt Gram-negativt med Gram-Hucker-fläcken, såsom vissa anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp och Brucella sp, kan färgas mycket bättre med hjälp av Kopeloffs modifiering av Gram-Hucker-fläcken, kallas Gram-Kopeloff-fläcken.

Denna teknik ändrar safraninfärgämnet till basisk fuchsin. Med denna modifiering är det möjligt att effektivt färga de ovannämnda mikroorganismerna.

Reagenslagring

Beredda färgämnen bör förvaras vid rumstemperatur.

Beredning av smet av provet som ska färgas

Ett prov måste innehålla minst 10 ⁵ mikroorganismer före observation av mikroorganismen i ett utstryk är sannolik. Utstrykningen kan tillverkas från direktprovet eller från kulturer i fasta eller flytande medier.

Smetarna ska vara enhetliga, väl fördelade och inte för tjocka för att bättre kunna visualisera de närvarande strukturerna.

-Gram direktprover

Gram av okentrifugerad urin

Urinen blandas och 10 pl placeras på en bild. Observationen av minst ett bakterie- / doppfält indikerar att det finns en infektion.

Detta innebär att kulturen kommer att ha ungefär mer än 100 000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) urin i 85% av fallen.

Den här metoden är inte användbar för koloniträtter under 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF bör centrifugeras, supernatanten tas bort och pelleten sprids på en bild. Denna vätska är steril under normala förhållanden; observation av bakterier indikerar infektion.

Gram av andningsprover

Sputum Gram, bronchial eller bronchoalveolar sköljning, även om det kan finnas en mängd olika mikroorganismer, kommer alltid att vägleda diagnosen, förutom att den är användbar den typ av celler som observerats.

När det gäller sputum bör smetet beredas med de mest purulenta delarna av provet.

Gram av pall

Det rekommenderas inte att utföra en Gram på denna typ av prover, eftersom den inte har något diagnostiskt värde.

-Gram av grödor

De kan göras på två sätt, ett från flytande kulturer och det andra från fasta kulturer.

Flytande kulturer

Från flytande kulturer är det extremt enkelt; Flera stek av den molniga buljongen tas under brännaren och placeras på en ren och torr rutschbana, vilket gör cirkulära rörelser från mitten mot periferin, för att fördela materialet jämnt.

Låt det torka spontant i luften. När det är torrt fixeras materialet på arket med värme. För att göra detta, med hjälp av en pincett, leds arket 3 till 4 gånger genom lågan hos Bunsen-brännaren och se till att inte bränna materialet.

Arket får svalna och placeras på färgbryggan.

Fasta grödor

Gör så här för att utföra en smet för Gram-fläck från en fast kultur:

Innan du väljer de kolonier som ska tas, bör bilden förberedas och placera ungefär två droppar steril fysiologisk saltlösning.

Om den ursprungliga kulturplattan innehåller flera olika typer av kolonier kommer en isolerad koloni av vardera att väljas för att utföra Gram. Varje koloni kommer att tas med platinoslingan för att lösa upp i saltlösningen som tidigare placerats på objektglaset.

Cirkulära rörelser görs från mitten mot periferin för att homogent fördela kolonin på bilden.

Låt det torka spontant i luften. När det är torrt fixeras arket med värme, såsom förklarats tidigare (genom att flamma bilden med tändaren), och se till att inte bränna materialet.

Denna procedur måste göras med varje olika kolonityper. På ett papper bör ordningen på vad som observeras noteras, till exempel:

Koloni 1: Betahemolytisk gul koloni: Grampositiva kockor observerades i kluster

Koloni 2: Krämfärgad koloni, utan hemolys: Gramnegativa coccobacilli observerades.

Varje bild måste märkas för att veta vad vi observerar.

Metod

Gram-färgningstekniken är extremt enkel att utföra och relativt billig och kan inte missas i ett mikrobiologiskt laboratorium.

Det görs på följande sätt:

1. Fixa utstrykningen med värme och placera på färgningsbryggan.
2. Täck bilden helt med kristallfiolett i 1 minut.
3. Tvätta med vatten Torka inte
4. Täck lakan med lugolösning, låt verka i 1 minut. Tvätta med vatten Torka inte.
5. Blek i 5-10 sekunder med försiktig skakning av alkoholaceton. Eller placera arket i vertikalt läge och släpp dropparna av avfärgningsmedlet på ytan tills överskottet av obehärdat violett glas har tagits bort. Överskrid inte.
6. Tvätta med vatten Torka inte.
7. Byt ut bilden på färgningsbryggan och täck den under 30 sekunder med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med basisk fuchsin (Gram-Kopeloff).
8. Tvätta med vatten
9. Låt den torka spontant i upprätt läge.

När det är torrt placerar du en droppe nedsänkningsolja för att observera den under 100X målet i ljusmikroskopet.

Verktyg

Denna teknik gör det möjligt att skilja de morphotintoriella skillnaderna hos de flesta bakterier.

Jäst kännetecknas också av denna färg. De tar kristallviolet, det vill säga de färgar Gram positivt.

Å andra sidan kan spordannande Gram-positiva stavar särskiljas, där ett tydligt utrymme observeras i bacillus, där endosporen bildas, även om sporerna inte fläckar väl. Andra tekniker som Shaeffer-Fulton används för att färga sporer.

Det bör noteras att denna färgning inte används för att färga alla typer av bakterier, det vill säga att det finns fall där färgningen inte fungerar.

I detta fall kan bakterier som saknar en cellvägg nämnas. Till exempel: släkt Mycoplasma, sfäroplaster, ureaplasma, L-former och protoplaster.

Det fläckar också mycket dåligt bakterier med väggar rika på mykolsyror, såsom Mycobacteria, och intracellulära bakterier som Chlamydias och Rickettsias.

Det är också ineffektivt för att färga de flesta spiroketalbakterier.

Det finns bakterier av samma släkt som kan observeras i samma prov som Gram-positiva och Gram-negativa. När detta händer det kallas variabel Gram-fläck, vilket kan bero på förändringar i näringsämnen, temperatur, pH eller elektrolytkoncentration.

Vanliga misstag

Överdriven blekning

Överdrivning i missfärgningssteget kan leda till observation av falska Gram-negativa mikroorganismer.

Väntar inte tillräckligt lång torktid för att tillsätta nedsänkningens olja

Det kan få Gram-positiva bakterier att färga Gram-negativa (falska Gram-negativa). Detta händer eftersom det i gamla kulturer troligen finns döda eller bortskämda bakterier och under dessa förhållanden behåller bakterierna inte kristallvioletten.

Använd mycket gammal lugollösning:

Med tiden förlorar lugolen sina egenskaper och färgen bleknar. Om det redan degenererade reagenset används fixerar det inte kristallviolet bra, därför finns det en möjlighet att få en visualisering av falskt Gram-negativa mikroorganismer.

Blå bakgrund

En korrekt missfärgad bakgrund blir röd. En blå bakgrund indikerar att missfärgningen var otillräcklig.

referenser

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, 6: e upplagan McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. (5: e upplagan). Argentina, Redaktion Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiologisk diagnos. 12 utg. Argentina. Redaktionell Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Allmän mykologi. 2: a upplagan Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
5. "Gram stain." Wikipedia, den fria encyklopedin. 4 okt 2018, 23:40 UTC. 9 dec 2018, 17:11. Hämtad från es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual of Medical Microbiology. 2: a upplagan, Venezuela: Direktoratet för medier och publikationer vid University of Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grundfläckar i mikrobiologilaboratoriet. Forskning om funktionshinder. 2014; 3 (1): 10-18.