GIEMSA-FLÄCK: SKÄL, MATERIAL, TEKNIK OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDEN - BIOLOGI - 2025

Den Giemsa-färg är en typ av färgning kliniska prover, räknat på blandningen av sura och basiska färgämnen. Skapandet har inspirerats av det arbete som Romanowsky gjorde, där Gustav Giemsa, en kemist och bakteriolog ursprungligen från Tyskland, perfekterade det genom att tillsätta glycerol för att stabilisera föreningarna.

De förändringar som genererades i den ursprungliga Romanowsky-tekniken tillät betydligt förbättra de mikroskopiska observationerna, därför döptes tekniken med namnet Giemsa-fläck.

Olika prover färgade med Giemsa-fläck. A. Trypanosoma evansi i perifert blod. B. Normala blodceller. C. Borrelia theileri i perifert blod. D. Burkitt's lymfom.

Eftersom det är en enkel teknik att utföra, mycket funktionell och ekonomisk, används den för närvarande i det kliniska laboratoriet för hematologiska utstryk, benmärgsprover och vävnadssektioner.

Giemsa-färgningstekniken är mycket användbar för cytologiska studier, eftersom den möjliggör observation av specifika cellstrukturer. Denna teknik fläckar cytoplasmer, kärnor, nukleoli, vakuoler och granulat av celler, för att kunna skilja jämna fina spår av kromatin.

Vidare kan signifikanta förändringar i kärnans storlek, form eller färgning detekteras, där det är möjligt att visualisera förlusten av förhållandet mellan kärnan och cytoplasma.

Å andra sidan tillåter det att identifiera omogna celler i benmärg och perifert blod, vilket är viktigt för diagnosen allvarliga sjukdomar såsom leukemi. Det är också möjligt att upptäcka hemoparasiter, extra och intracellulära bakterier, svampar, bland andra.

I cytogenetik används det allmänt eftersom det är möjligt att studera mitos hos celler.

Grund för Giemsa-färgning

Romanowsky-färgämnen baseras på att använda en kontrast mellan sura och basiska färgämnen för att uppnå färgning av basstrukturen respektive syrestrukturerna. Som framgår finns det en affinitet av sura färgämnen för att färga grundläggande strukturer och vice versa.

Det basiska färgämnet som används är metylenblått och dess oxiderade derivat (Azure A och Azure B), medan det sura färgämnet är eosin.

Cellernas syrestrukturer är nukleinsyrorna, granulerna av de segmenterade basofilerna, bland annat, därför kommer de att färgas med metylenblått.

I samma mening är de grundläggande strukturerna i cellerna hemoglobin och vissa granuler, såsom de som finns i segmenterade eosinofiler, bland andra; dessa kommer att färgas med eosin.

Å andra sidan, på grund av det faktum att metylenblått och azurblått kännetecknas av att vara metakromatiska färgämnen, kan de tillhandahålla en variabel nyans för de olika strukturerna beroende på belastningen av polyanjoner som de besitter.

Så här lyckas den strategiska kombinationen av basiska och sura färgämnen utveckla ett brett spektrum av färger, i enlighet med de biokemiska egenskaperna hos varje struktur, genom att gå genom ljusblå, mörkblå, lila och lila nyanser för syrestrukturer.

Medan färgningen som ges av eosin är mer stabil, genererar färger mellan röd-orange och lax.

material

Material för beredning av lagerlösningen

Beredning av stamlösningen kräver vägning av 600 mg pulveriserad Giemsa-fläck, mätning av 500 cm acetonfri metylalkohol och 50 ml neutral glycerin.

Hur man förbereder lagerlösningen

Lägg det tunga Giemsapulvret i en murbruk. Om det finns klumpar bör de sprayas. Tillsätt därefter en avsevärd mängd av det uppmätta glycerinet och blanda mycket väl. Den erhållna blandningen hälls i en mycket ren bärnstensflaska.

Resten av glycerinet placeras i murbruk. Blanda igen för att rengöra resten av färgämnet som har fastnat i murbrukens väggar och häll i samma burk.

Flaskan täckes och placeras i ett vattenbad vid 55 ° C i 2 timmar. Skaka försiktigt blandningen varannan halvtimme medan den ligger i ett vattenbad.

Därefter får blandningen svalna för att placera alkoholen. Tidigare placeras en del av den uppmätta alkoholen i murbruk för att avsluta tvätta den återstående färgämnet och sedan tillsätts den till blandningen tillsammans med resten av alkoholen.

Denna beredning bör lämnas till mogna i minst 2 veckor. Den använda delen av stamlösningen ska filtreras.

För att undvika kontaminering av beredningen rekommenderas att du överför den del som kommer att användas i ständig användning till en liten bärnstensflaska med en dropper. Fyll på varje gång reagenset tar slut.

Material för att förbereda buffertlösningen

Å andra sidan framställs en buffertlösning vid pH 7,2 enligt följande:

6,77 g natriumfosfat (vattenfritt) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kaliumdivätefosfat (KH ₂ PO ₄ är) och destillerat vatten vägdes upp till 1000 cc.

Slutförberedelse av färgämnet

För beredningen av den slutliga färgningslösningen mäts 2 ml av den filtrerade stamlösningen och blandas med 6 ml buffertlösning. Rör om blandningen.

Ett relevant faktum som måste beaktas är att färgberedningsteknikerna kan ändras beroende på det kommersiella företaget.

Ytterligare material som behövs för att utföra färgningen

Bortsett från de beskrivna materialen måste du ha färgbryggor, t-shirts med vatten eller buffert för tvätt, objektglas eller skydd för föremål, ett stoppur för att kontrollera färgningstider och blottingpapper eller något material som kan användas för att torka ( gasväv eller bomull).

Metod

Färgningsprocess

1) Innan färgning måste provets utstrykning vara klar på en ren bild.

Proven kan vara blod, benmärg, histologiska vävnadssektioner eller cervico-vaginala prover. Det rekommenderas att spridningarna ska vara tunna och ha 1 eller 2 timmars torkning innan färgning.

2) Placera alla ark som måste färgas på en färgbrygga. Du arbetar alltid i samma ordning och varje ark är väl identifierat.

3) Placera några droppar 100% metylalkohol (metanol) på smet och låt det verka i 3 till 5 minuter för att fixera och dehydratisera provet.

4) Kassera metanol som finns på arket och låt lufttorka.

5) När den är torr, lägg den slutliga färgningslösningen med en droppare tills hela arket täcks. Låt att agera i 15 minuter. Vissa författare rekommenderar upp till 25 minuter. Det beror på affärshuset.

6) Tappa fläcken och tvätta utstrykningen med destillerat vatten eller med en 7,2 buffertlösning.

7) Låt lakan torka i friluft på ett blottingpapper, anordnat vertikalt med hjälp av ett stöd.

8) Rengör baksidan av objektglaset med en alkoholpinne eller bomullspinne för att ta bort spår av fläckar.

verktyg

Giemsa-färgningstekniken används inom olika områden, inklusive: hematologi, mykologi, bakteriologi, parasitologi, cytologi och cytogenetik.

Hematology

Det är den vanligaste användningen av denna fläck. Med den kan var och en av cellerna som finns i benmärg eller perifert blodprov identifieras. Förutom att uppskatta antalet i varje serie, kunna upptäcka leukocytos eller leukopeni, trombocytopeni etc.

Eftersom det är känsligt när det gäller att identifiera omogna celler är det relevant vid diagnosen akuta eller kroniska leukemier. Det är också möjligt att ställa diagnos av anemi, såsom sigdcellanemi, sigdcell, bland andra.

Mykologi

I detta område är dess användning vanligt att söka efter Histoplasma capsulatum (intracellulär dimorf svamp) i vävnadsprover.

Bakteriologi

Vid hematologiska utstryk som är färgade med Giemsa är det möjligt att upptäcka Borrelias sp hos patienter som förekommer med sjukdomen som kallas återkommande feber. Spiroketer finns rikligt bland erytrocyter, i prover som tagits vid topp av feber.

Det är också möjligt att visualisera intracellulära bakterier såsom Rickettsia sp och Chlamydia trachomatis i infekterade celler.

parasitologi

Inom området parasitologi har färgning av Giemsa gjort det möjligt att diagnostisera parasitsjukdomar som malaria, Chagas sjukdom och leishmaniasis.

I de första två, Plasmodium sp respektive Trypanosoma cruzi parasiter, kan ses i perifert blod hos infekterade patienter, de kan hittas i olika stadier beroende på sjukdomens stadium.

För att förbättra sökningen efter parasiter i blod, rekommenderas det att använda Giemsa-fläcken blandad med May-Grünwald-fläcken.

På samma sätt kan kutan leishmaniasis diagnostiseras genom att utvärdera Giemsa-färgade hudbiopsiprover där parasiten finns.

Cytologi

Giemsa-färgning används också för den cytologiska studien av endocervikala prover, även om det inte är den mest använda tekniken för detta ändamål.

Men i fall med brist på resurser kan den användas, med en liknande funktionalitet som den som erbjuds av Papanicolaou-tekniken och till en lägre kostnad. Det kräver emellertid expertis från examinator.

cytogenetik

En relevant egenskap hos Giemsa-färgning är dess förmåga att binda starkt till adenin- och tyminrika regioner av DNA. Detta gör det möjligt att visualisera DNA under cellmytos, i olika kondensstillstånd.

Dessa studier är nödvändiga för att detektera kromatiska avvikelser såsom duplikationer, deletioner eller translokationer av de olika regionerna i kromosomerna.

Forskning som visar effekten av Giemsa-fläck

Cannova et al (2016) jämförde 3 färgningstekniker för diagnos av kutan leishmaniasis.

För detta använde de prover erhållna från ett försöksdjur (Mesocrisetus auratus) som experimentellt inokulerades med Leishmanias.

Författarna visade att Giemsa-fläcken var bättre än Pap-mart®- och Gaffney-fläcken. Därför ansåg de Giemsa-fläcken vara idealisk för att diagnostisera kutan leishmaniasis.

De utmärkta resultaten som uppnåtts av författarna beror på det faktum att kombinationen av färgämnen som utgör Giemsa-blandningen uppvisar de nödvändiga förutsättningarna för att skapa en gynnsam kontrast, vilket gör att strukturerna för amastigoter kan tydligt särskiljas, både intracellulärt och extracellulärt.

De andra teknikerna (Pap-mart® och Gaffney) gjorde det också, men på ett svagare sätt och därför svårare att visualisera. Därför rekommenderas Giemsa-fläcken för parasitologisk diagnos av leishmaniasis.

På liknande sätt utvärderade en studie av Ramírez et al (1994) giltigheten av Giemsa och Lendrum-fläckar i konjunktivstänk för identifiering av Chlamydia trachomatis.

Författarna bestämde att Giemsa och Ledrum-fläckar har lika specificitet, men Giemsa befanns vara mer känsliga.

Detta förklarar varför Giemsa-fläcken för närvarande är den mest använda för diagnos av klamydiala infektioner, särskilt om det finns få resurser.

Källa: PanReac Applichem ITW-reagens. Giemsa-fläck. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.

Rekommendationer för god färgning

Torkningen av arken bör inte påskyndas. En rimlig tid måste förväntas för att torka den i friluft. Cirka 2 timmar.

Färg direkt efter 2 timmar för bästa resultat.

För att smetarna ska fixeras och färgas bättre måste provet fördelas på objektglaset på ett sådant sätt att ett tunt och enhetligt skikt kvarstår.

Det föredragna blodprovet är kapillärt eftersom smetningen görs direkt från bloddroppen och därför innehåller provet inga tillsatser, vilket gynnar upprätthållandet av cellstrukturer.

Om venöst blod används bör EDTA emellertid användas som antikoagulant och inte heparin, eftersom heparin vanligtvis deformerar celler.

Vanliga misstag vid Giemsa-färgning

I praktiken av detta målarfel kan göras. De bevisas av plötsliga förändringar i strukturernas tonaliteter.

Extremt blå färg

Det kan bero på:

• Mycket tjocka utstryk
• Överskridande färgningstid
• Tvätta otillräckligt.
• Användning av reagenser långt över neutralt (alkaliskt) pH.

Under dessa förhållanden är färgerna på följande strukturer förvrängda, på ett sådant sätt att erytrocyterna istället för färgning av laxrosa kommer att visas gröna, granulerna i eosinofilerna som måste färgas tegelröda blir blåaktiga eller gråa och så vidare kommer det att vara avvikelse i vanliga toner.

Mycket rosa färg

Det kan bero på:

• Otillräcklig färgningstid.
• Långvarig eller överdriven tvätt.
• Dålig torkning.
• Användning av mycket sura reagens.

I detta specifika fall kommer strukturer som normalt färgar blått inte att vara nästan synliga, medan strukturer som färgar rosa kommer att ha kraftigt överdrivna nyanser.

Exempel: Röda blodkroppar blir ljusröda eller ljust orange, kärnkromatin kommer att bli ljusrosa och eosinofilgranulat färgar djup ljusrött.

Närvaro av utfällningar i smet

Orsakerna kan vara:

• Använd smutsiga eller dåligt tvättade filmer.
• Låt inte utstrykningen torka väl.
• Lämna fixeringslösningen för länge.
• Otillräcklig tvätt i slutet av färgningen.
• Otillräcklig filtrering eller ingen filtrering av färgämnet som används.

Närvaro av morfologiska artefakter

Morfologiska artefakter kan förekomma i utstryk, vilket gör det svårt att visualisera och tolka de närvarande strukturerna. Detta beror på:

• Typ av antikoagulantia som används, såsom heparin.
• Användning av smutsiga, försämrade eller oljiga filmer.

Lagringsläge

Efter beredning måste färgämnet hållas vid rumstemperatur (15 - 25 ° C) för att förhindra att färgämnet faller ut. Det ska förvaras i en tätt slutet bärnstenbehållare.

referenser

1. Cannova D, Brito E och Simons M. Utvärdering av färgningstekniker för diagnos av kutan Leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW-reagens. Giemsa-fläck. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.
3. Clark G. Staining procedures (1981), 4: e. Williams & Willkins.
4. Tillämpad klinisk kemi. Giemsa-färg för in vitro-diagnostik. Distributör: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F och Grazioso C. Giltighet av fläckar i Giemsa och Lendrum i konjunktivutstryk för identifiering av Chlamydia trachomatis. Sanit Panam-bolten. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Allmän mykologi. 1994. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa-fläck." Wikipedia, den fria encyklopedin. 1 september 2017, 01:02 UTC. 6 december 2018, es.wikipedia.org.