ZIEHL-NEELSEN-FLÄCK: SKÄL, REAGENS OCH TEKNIK - BIOLOGI - 2025

Den Ziehl-Neelsen en färgande teknik för att identifiera mikroorganismer resistenta alkohol syra (ARA). Namnet på detta mikrobiologiska förfarande hänvisar till dess författare: bakteriolog Franz Ziehl och patolog Friedrich Neelsen.

Denna teknik är en typ av differentiell färgning, vilket innebär användning av olika färgämnen för att skapa kontrast mellan de strukturer som du vill observera, differentiera och senare identifiera. Ziehl-Neelsen-fläcken används för att identifiera vissa typer av mikroorganismer.

Ziehl-Neelsen-fläck

Vissa av dessa organismer är mycobacteria (t.ex. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (t.ex. Nocardia sp.) Och några unicellular parasiter (t.ex. Cryptosporidium parvum). Många av bakterierna kan klassificeras genom en vanlig teknik som kallas en Gram-fläck.

Vissa bakteriegrupper kräver emellertid andra metoder för att kunna identifiera dem. Tekniker som Ziehl-Neelsen-fläcken kräver kombinationer av färgämnen med värme för att fixera det förra till cellväggen.

Sedan kommer en blekprocess som möjliggör två resultat: resistens eller känslighet för missfärgning av syror och alkoholer.

Grund

Skälen för denna färgningsteknik är baserade på egenskaperna hos cellväggen hos dessa mikroorganismer. Väggen består av en typ av fettsyror som kallas mykolsyror; Dessa kännetecknas av att de har mycket långa kedjor.

När fettsyror har mycket långa strukturer kan de behålla färgämnen lättare. Vissa bakteriella släkter är mycket svåra att färga med Gram-fläckar på grund av det höga innehållet av mykolsyror i cellväggen.

Ziehl-Neelsen-fläcken använder fenolföreningen carbol fuchsin, en grundfärg. Detta har förmågan att interagera med cellväggens fettsyror, som är vaxartade i textur vid rumstemperatur.

Carbol-fuchsin-färgning förbättras i närvaro av värme, eftersom vaxet smälter och färgämnesmolekylerna rör sig snabbare in i cellväggen.

Syran som används senare tjänar till att missfärga celler som inte färgades eftersom deras vägg inte var tillräckligt relaterad till färgämnet; därför kan styrkan hos syrablekmedlet avlägsna det sura färgämnet. Celler som motstår denna missfärgning kallas syra-snabbt.

Sekundär färgämne

Efter avfärgning av provet kontrasteras det med ett annat färgämne som kallas sekundärfärgämne. I allmänhet används metylenblått eller malakitgrönt.

Det sekundära färgämnet färgar bakgrundsmaterialet och skapar följaktligen kontrast till strukturerna som färgades i det första steget. Endast missfärgade celler absorberar det andra färgämnet (försänkt) och tar på sig deras färg, medan syrasnabba celler behåller sin röda färg.

Denna procedur används ofta för identifiering av Mycobacterium tuberculosis och Mycobacterium leprae, som kallas syrasnabba baciller.

Reagens

Primär färgämne

0,3% karbolfuchsin (filtrerat) används. Detta färgämne framställs av en blandning av alkoholer: fenol i etanol (90%) eller metanol (95%), och i denna blandning löses 3 gram basisk fuchsin.

Blekningslösning

I detta steg kan lösningar av 3% alkoholhaltig syra eller 25% svavelsyra användas.

Sekundärfärgämne (mot färgämne)

Färgämnet som används mest för att kontrastera proverna är vanligtvis 0,3% metylenblått. Andra kan dock också användas, till exempel 0,5% malakitgrönt.

Metod

Syra-snabb färgningsprocedur

Förbered en bakteriesprut

Denna beredning görs på en ren, torr rutschka, efter sterilitetsförsiktighetsåtgärder.

Torkning

Låt utstryket torka vid rumstemperatur.

Värm provet

Provet ska värmas upp genom att applicera eld på bilden nedan. En alkoholfixering kan göras när smet inte har beredts med sputum (behandlat med natriumhypoklorit för att bleka det) och om det inte kommer att färga omedelbart.

M. tuberculosis avlägsnas med blekmedel och under färgningsprocessen. Värmefixering av obehandlad sputum dödar inte M. tuberculosis, medan alkoholfixering är bakteriedödande.

Täck fläcken

Fläcken täcks med carbol-fuchsinlösningen (primär grundfärg).

Värm fläcken

Detta görs i 5 minuter. Du bör märka en utveckling av ånga (cirka 60 ° C). Det är viktigt att inte överhettas och undvika att bränna provet.

När det gäller uppvärmning av fläcken måste stor försiktighet vidtas vid uppvärmning av carbol-fuchsin, särskilt om färgningen utförs på ett bricka eller annan behållare i vilken mycket brandfarliga kemikalier från den tidigare färgningen har samlats in.

Endast en liten flamma ska appliceras under objektglaset med en tidigare upplyst bomullstopp fuktad med några droppar sur alkohol, metanol eller 70% etanol. Undvik att använda en stor bomullstopp torr i etanol eftersom det är en brandrisk.

Tvätta fläcken

Denna tvätt måste göras med rent vatten. Om kranvattnet inte är rent ska du tvätta smöret med filtrerat eller destillerat vatten, helst.

Täck utstryket med sur alkohol

Denna sura alkohol bör vara 3%. Täckningen utförs i 5 minuter eller tills smetningen är tillräckligt missfärgad, dvs ljusrosa i färgen.

Det måste beaktas att sur alkohol är brandfarlig; därför måste den användas med stor omsorg. Undvik att vara i närheten av antändningskällor.

Tvätta fläcken

Tvätten ska ske med rent, destillerat vatten.

Täck smet med fläck

Det kan vara malakitgrön fläck (0,5%) eller metylenblått (0,3%) under 1 eller 2 minuter, med längre tid om smetningen är tunn.

Tvätta fläcken

Återigen ska rent (destillerat) vatten användas.

Tömma

Baksidan av sliden bör rengöras och fläcken placeras på ett avtappningsställ för att lufttorka (använd inte absorberande papper för torkning)

Undersök smet under mikroskopet

100X objektiv och nedsänkning olja måste användas. Skanna smutset systematiskt och registrera de relevanta observationerna.

Tolk resultaten

Teoretiskt anses mikroorganismer som färgar en rödaktig färg syra-snabbt positivt (AAR +).

Tvärtom, om mikroorganismerna fläckar blått eller grönt, beroende på färgämnet som används som motfärg, betraktas de som syrasnabba negativa (AAR-).

referenser

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1: a upplagan). Jaypee Brothers Medical Publisher.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologi med sjukdomar av kroppssystem (4: e upplagan). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Inledande mikrobiologi (1: a upplagan). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care (11: e upplagan). McGraw-Hill utbildning.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1: a upplagan). BI Publications PVT.