BIURET: SKÄL, REAGENS, PROCEDUR, ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den biuret är en reagens som används för proteinbestämning långkedjiga och kort kedja. Det används särskilt inom området analytisk kemi och urinalys för att undersöka koncentrationen av totala proteiner i serum, plasma och urin.

Proteinvärden kan ökas eller minskas i vissa patologier. Hypoproteinemi-symtom förekommer vanligtvis hos patienter med njursjukdom, hos underärda patienter och hos patienter med kroniska infektioner.

Kemisk struktur för komplexet bildat i Biuret-reaktionen Positivt Biuret-test. Källa: Yikrazuul / flickr

Medan hyperproteinemi observeras i patologier såsom multipelt myelom, systemisk lupus erythematosus, bakteriell endokardit, bakteriell meningit, Waldenströms makroglobulinemi, bland andra.

Å andra sidan beror närvaron av protein i urinen på filtrering av albumin från njurarna. Detta är patologiskt beteende som måste studeras.

I denna mening är Biuret mycket användbar, eftersom den gör det möjligt att kvantifiera närvaron av proteiner i serum, plasma, urin, bland många andra prover.

Till och med Biuret kan användas för att undersöka närvaron och koncentrationen av proteiner i dåligt undersökta prover eller prover med okänd sammansättning. Därför används den i stor utsträckning inom forskningsområdet.

Biuret-testet är baserat på detektering av peptidbindningar. Testet äger rum i ett alkaliskt medium. Provet måste innehålla minst två peptidbindningar för att bilda ett violet-lila komplex. Komplexet bildas av bindningarna och kopparjonen.

Grund

Biurets reagens består av kaliumhydroxid, kuprisulfat och natrium- och kaliumtartrat. Natriumhydroxid används för att alkalisera mediet eftersom detta tillstånd är viktigt för att reaktionen ska äga rum.

Ämnen som reagerar med proteiner är kuprisulfat, medan natriumtartrat har funktionen att inte tillåta bildning av kopparhydroxid, som tenderar att fälla ut och stör reaktionen.

Om ämnen med peptidbindningar (polypeptider eller proteiner) finns i provet kommer testet att vara positivt.

En reaktion tolkas som positiv när lösningen blir lila. Färgen produceras genom bildning av ett komplex mellan minst två peptidbindningar som har CO-NH-gruppen och de cupriska katjonerna.

Det violetta komplexet kan bildas på två sätt: det ena är genom förlust av protoner från amidgrupperna som binder till metallen (depronotation), och det andra genom föreningen av syre- och kväveelektroner som är fria och binder med koppar.

Denna reaktion kan variera i intensitet och färg beroende på typen av protein.

Testet kan utföras kvalitativt eller kvantitativt. I kvalitativ form rapporteras det som positivt eller negativt. Medan i kvantitativ form kan koncentrationen mätas med den spektrofotometriska metoden.

Reaktionen avläses mellan 540-560 nm. Färgens intensitet är direkt proportionell mot koncentrationen av peptidbindningar i provet.

Reagens

-20% natriumhydroxid (NaOH)

-Cupric sulfatpentahydrat 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

-Blandat natrium- och kaliumtartrattetrahydrat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Biuret-reagensstabilitet

-Det måste förvaras kylt.

Bearbeta

Metod

- Placera 100 pl av provet eller standarden som ska analyseras i ett provrör.

- Tillsätt 2 ml natriumhydroxid.

-Mix mycket bra.

-Tillsätt 5 ml Biuret-reagens.

-Blanda och låt vila i 25 minuter vid rumstemperatur, täck och skydd mot ljus.

-Abserera bildningen eller inte av färg och mät spektrofotometriskt.

Kalibreringskurva

Bovint serumalbumin kan användas som standard för att utföra kalibreringskurvan. Olika koncentrationer framställs ur det. Till exempel 25, 50, 75, 100, 125 och 150%.

Reaktionen sätts upp med alla dessa kända koncentrationer och absorbansen avläses vid en våglängd av 540 nm. Med data för de kända koncentrationerna och absorbansavläsningarna görs kalibreringskurvan.

Vid varje bestämning eller batch av bearbetade prover rekommenderas det att montera en standard. Bovint serumalbumin 0,1-2 mg / ml kan användas som en kalibreringsstandard.

Mätningar görs på en spektrofotometer vid 540 nm.

Linearitet uppnås till en koncentration av 12 g / dl.

Interferens

Ämnen som påverkar Biuret-testet

Även om det inte är så ofta, bör det noteras att vissa ämnen kan störa under genomförandet av detta test. Exempelvis kan närvaron av ammoniak hämma färgbildning.

På samma sätt kan andra ämnen absorbera vid samma våglängd, såsom vissa pigment.

Å andra sidan kan störningar alstras när ett annat ämne än peptidbindningen bildar ett komplex med koppar-saltet. Exempel: vissa kolhydrater och vissa lipider.

Om provet som ska analyseras presenterar någon typ av fällning måste det filtreras eller centrifugeras innan testet monteras.

Ämnen som inte stör Biuret-testet

Testet påverkas inte av närvaron av:

-Bilirubin upp till en koncentration av 20 mg / dl.

-Hemoglobin upp till en koncentration av 750 mg / dl.

-Extran upp till en koncentration av 30 g / L

-Triglycerider upp till en koncentration av 4000 mg / dl.

Fördel

-Det är en enkel metod att utföra.

-Det är ett ekonomiskt test.

-Det har hög specificitet för proteiner.

-Liten störning.

nackdelar

Det har dålig känslighet för att upptäcka låga mängder protein. Arbetet utförs av Fuentes et al. Bekräftar att Biuret-testmetoden har en detektionsgräns på 1 mg / ml protein och en kvantifieringsgräns på 3 mg / ml.

Men annan forskning som genomförts vid University of Amazonia rapporterar mycket lägre värden. Detektionsgränsen som rapporterats av studien är 0,020 mg / ml och kvantifieringsgränsen är 1,33 mg / ml.

tillämpningar

Biuret-reagenset eller testet används för bestämning av proteiner i kliniska och icke-kliniska prover i rutin- och forskningslaboratorier.

Patologier som uppstår med en ökning eller minskning i

I många patologier är det viktigt att bestämma koncentrationen av totala proteiner i kliniska prover, som kan förhöjas eller minskas.

De är förhöjda i:

-Multiple myelom,

-Systemisk lupus erythematosus,

-Bakteriell endokardit,

-Bakteriell meningit,

Waldenströms makroglobulinemi, bland andra.

Det minskas i:

-Renal insufficiens,

-Personer med svåra undernäringsgrader,

-Patienter med kroniska infektioner, bland andra.

Kliniska prover

De vanligaste kliniska proverna är serum, plasma och urin. Det normala värdet på proteiner i serum eller plasma är 6,0-8,8 gr / dl.

Koncentrationen av proteiner i urinen hos vuxna överstiger inte 150 mg / 24 timmar.

Urinprotein / urin-kreatininförhållande normalt värde

Spädbarn: <0,50 mg

Barn 2 år och äldre: index: 0,20 mg

Vuxna: <0,2 mg

Icke-kliniska prover

Biuret-reaktionen kan användas för många typer av icke-kliniska prover, såsom mejeriprodukter, antivenom eller något okänt ämne som du vill undersöka närvaron av proteiner.

referenser

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fysikalisk-kemisk karaktärisering och proteininnehåll i vätskeextrakt från mangrove-ostron (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Hämtad 26 juni 2019 från http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Funktionell karaktärisering av mandel av mangofrön (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret." Wikipedia, den fria encyklopedin. 19 juni 2019, 16:37 UTC. 26 juni 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardisering av Biurets metod för att kvantifiera totala proteiner i polyvalent antibotropiskt serum producerat vid INS National Center for Biological Products. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Finns på: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Totala proteiner. Kolorimetrisk metod för bestämning av totala proteiner i serum och plasma. Finns på: wiener-lab.com.ar