FOSFATBUFFERT (PBS): SKÄL, BEREDNING OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den fosfatbuffert, fosfatbuffrad saltlösning eller BPS är en buffert isoton, vars funktion är att upprätthålla pH och osmotiskt tryck så nära den naturliga biologiska omgivningen (fysiologisk). Förkortningen PBS står för fosfatbuffrad saltlösning.

PH och osmolaritet är två mycket viktiga aspekter som måste kontrolleras i vissa laboratorieprotokoll. När det gäller pH är det väsentligt att det kontrolleras, speciellt vid biokemiska reaktioner, eftersom dessa kan variera eller inte utföras om reaktanterna har ett olämpligt pH.

PBS-fosfatbuffrad saltlösning vid två olika pH-värden. Källa: Pixinio.com

Under tiden är kontrollen av osmolaritet väsentlig, särskilt när man arbetar med levande celler, eftersom cellernas plasmamembran reagerar i enlighet med koncentrationen av lösta ämnen i vilka de finns.

Om cellerna överförs till ett hypertoniskt medium kommer de att dehydratiseras, eftersom vattengradienten kommer att transporteras till sidan där det finns en högre koncentration av lösta ämnen. Om celler å andra sidan placeras i ett hypotoniskt medium, kommer cellerna att absorbera vätska tills de lyseras.

Det är därför PBS-buffert används för laboratorieprotokoll som kräver underhåll av celler in vitro, på detta sätt kommer cellerna inte att skadas.

PBS består av en kombination av salter, såsom natriumklorid, natriumfosfat, kaliumklorid och kaliumfosfat. Kompositionen för PBS kan variera beroende på protokollet.

Grund

I grund och botten är fosfatbuffertens funktion att upprätthålla ett konstant fysiologiskt pH tillsammans med en elektrolytkoncentration liknande den som finns i kroppen.

I denna miljö kan celler förbli stabila eftersom fysiologiska förhållanden simuleras så mycket som möjligt.

Andra föreningar kan tillsättas till den ursprungliga PBS-formuleringen vid behov, till exempel är tillsatsen av EDTA till bufferten användbar för att tvätta röda blodkroppar i tvärkompatibilitetstestet.

EDTA förhindrar att fraktionen av komplement C1 som finns i serumet klyvs och lyseras till röda blodkroppar, det vill säga att det undviker falska inkompatibilitetsresultat. Dessutom hjälper EDTA att dissociera celler.

Förberedelse

Mängden salter som måste vägas för beredningen av PBS-fosfatbuffrad saltlösning beror på den mängd som måste beredas:

-Fosfatbuffrad saltlösning (10X PBS)

För en liter lösning:

Att väga:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Beredningsteknik

Placera de tunga salterna i en bägare, tillsätt tillräckligt med vatten (80%) och blanda på omrörningsplattan med magnetstång tills salterna har lösts.

Beredning av PBS med användning av en omrörningsplatta med en magnetstång. Källa: Användare: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrera för att ta bort olösta partiklar. Använd filter med porer på 0,45 um. Autoklavera och distribuera aseptiskt i en laminär flödeshuva i glasburkar med lock.

10X-lösningen (koncentrerad) justerar inte pH. Justeringen görs en gång utspädd till 1X PBS buffertkoncentration, (1:10 utspädning).

-Buffer fosfat saltlösning (1X PBS)

1X PBS kan framställas direkt, väga motsvarande mängder av varje salt, eller det kan framställas genom att späda stamlösningen (1:10) med sterilt destillerat vatten.

-Förbereda direkt en liter 1X PBS fosfatbuffrad saltlösning, väga:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Beredningsteknik

Fortsätt som förklarats i den koncentrerade lösningen. Därefter måste pH justeras. För att göra detta, mät pH och beroende på resultatet använder du syra (HCl) eller bas (NaOH) för att sänka respektive höja pH vid behov tills det är 7,4.

Syran eller basen tillsättes dropp för droppe under övervakning av pH-värdet för lösningen med användning av en pH-mätare. Filtrera, autoklav och fördela aseptiskt i koniska rör eller burkar efter behov.

-Förbereda 1X PBS från 10X lagerlösningen:

Gör en 1:10 utspädning. Till exempel, för att bereda 1 liter 1X PBS, mät ut 100 ml av stamlösningen och tillsätt 700 ml sterilt destillerat vatten. Justera pH och fyll mängden vatten upp till 1000 ml.

Den beredda PBS-bufferten är färglös och klar.

Daglig PBS kan lagras vid rumstemperatur och resten i kylskåpet.

Lösningar för pH-justering

HCl

För 100 ml 1 mol HCL (saltsyra).

Mät 91 ml destillerat vatten och placera det i ett 250 ml bägare.

Mät 8,62 ml koncentrerad HCl och tillsätt den långsamt i bägaren som innehåller vattnet (gör det inte tvärtom). Vidta lämpliga biosäkerhetsåtgärder vid hantering av starka syror (mycket frätande ämne).

Blanda i 5 minuter, helst med en omrörningsplatta med en magnetstång inuti glaset. Överföring till en 100 ml kolv och fyll upp till 100 ml med destillerat H ₂ O.

NaOH

För 100 ml NaOH (natriumhydroxid) 10 molar.

Mät 40 ml destillerat vatten och placera det i ett 250 ml bägare. Mät 40 g NaOH och tillsätt i vattnet. Blanda med en omrörningsplatta med en magnetstång inuti glaset.

Överför till en 100 ml mätkolv och fyll på märket med destillerat vatten. Följ bestämmelserna om biosäkerhet eftersom denna reaktion är exoterm (den frigör energi i form av värme).

Om du vill bereda andra mängder fosfatlösning kan du se följande tabell:

Källa: «Laboratory of Viral and Human Genomics, UASLP School of Medicine»

tillämpningar

Det används främst inom cellbiologi, immunologi, immunohistokemi, bakteriologi, virologi och forskningslaboratorier.

Det är idealiskt för celltvätt genom centrifugering (röda blodkroppar), tvätt av cellskikt, i spektroskopisk ellipsometri, vid kvantifiering av bakteriella biofilmer, för att upprätthålla cellkulturer för virus, som en tvättlösning i den indirekta immunofluorescens-tekniken och i tekniker för karakterisering av monoklonala antikroppar.

Det används också för att transportera celler eller vävnader, som ett utspädningsmedel för cellräkning, framställning av cellulära enzymer (trypsin), som ett utspädningsmedel för biomolekylens uttorkningsmetod och för att framställa andra reagens.

Å andra sidan demonstrerade Martin et al. 2006 att PBS är användbart i kriminaltekniska laboratorier, speciellt vid återhämtning av spermier från vaginala utstryk, eller vid återhämtning av vaginalceller från penisspritt. På detta sätt kan det fastställas om det har varit en sexuell relation.

begränsningar

-Vissa PBS-buffertar innehåller ett ämne som kallas natriumazid som konserveringsmedel. Denna förening kan generera explosiva ämnen om den kommer i kontakt med bly eller koppar. Av detta skäl måste särskild försiktighet vidtas när detta reagens kastas ner i avloppet. Om det kastas på detta sätt måste mycket vatten tillsättas för att späda det så mycket som möjligt.

-Zink bör inte tillsättas fosfatbufferten, eftersom det får vissa salter att fälla ut.

-Wangen och kollaboratörer under 2018 bestämde att användningen av PBS inte var lämplig för att tvätta primära celler av akut myelooid leukemi (AML) extraherad från perifert blod, på grund av att många celler går förlorade genom lys, med en stor minskning av materialet protein.

Därför bestämde de att primära AML-celler inte skulle tvättas med PBS efter lagring i flytande kväve.

referenser

1. Coll J. (1993). Diagnostiska tekniker i virologi. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cellkultur. Ändring av medium. Institutionen för normal och patologisk cytologi och histologi University of Seville. Finns på personal.us.es
3. Framställning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). (2008). Standard Operations Procedures (SOPs) Human and Viral Genomics Laboratory UASLP School of Medicine. Finns på: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfatbuffersaltlösning." Wikipedia, den fria encyklopedin. 3 april 2019, 19:36 UTC. 13 april 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Ämnen i molekylär biofysik. Finns på: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manuell. PBS + EDTA. Finns på: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Användning av fosfatbuffrad saltlösning för återvinning av celler och spermatozoer från vattpinnar. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Finns i: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Konserveringsmetod och fosfatbuffrad saltlösningstvätt påverkar det akuta myeloida leukemiproteomet. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Finns i: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teoretiska och praktiska grunder för histokemi. Överlägset råd för vetenskapliga undersökningar. Madrid. Finns på: books.google.co.ve