UREA BULJONG: FOUNDATION, BEREDNING OCH ANVÄNDNING - BIOLOGI - 2025

Den ureabuljong är ett flytande odlingsmedium, som används för att detektera närvaron av ureasenzym i vissa mikroorganismer. Ureas är ett mikrobiellt enzym som produceras på ett konstitutivt sätt, det vill säga det syntetiseras oavsett om substratet som den verkar på finns eller inte.

Ureas funktion är relaterad till nedbrytning av organiska föreningar. Inte alla mikroorganismer kan syntetisera detta enzym, varför dess bestämning i laboratoriet gör det möjligt att identifiera vissa bakteriestammar och till och med skilja mellan arter av samma släkt.

Negativt och positivt ureatest. Källa: Foto taget av författaren MSc. Marielsa Gil.

Det finns två typer av urea-test: Stuart och Christensen. De skiljer sig åt i sammansättning och känslighet. Den första är speciell för att visa en stor mängd ureas som produceras av arter av släktet Proteus.

Den andra är mer känslig och kan upptäcka små mängder ureas som genereras sent av andra bakteriegener, såsom Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter och Mycobacterium.

Stuarts urea buljong består av urea, natriumklorid, Dipotassium fosfat, Monopotassium fosfat, jästextrakt, fenolrött och destillerat vatten.

Samtidigt består Christensens ureabuljong eller agar av peptoner, natriumklorid, monopotassiumfosfat, glukos, karbamid, fenolrött, destillerat vatten och agar-agar. Det senare endast om det är det fasta mediet.

Grund

Enzymet urease hydrolyserar karbamid och bildar koldioxid, vatten och två molekyler av ammoniak. Dessa föreningar reagerar och bildar slutprodukten kallad ammoniumkarbonat.

Stuarts urea buljong

Stuarts ureabuljong buffras mer med ett pH på 6,8. Därför måste mikroorganismen kunna bilda stora mängder ammoniak för att bli fenolröd. PH bör stiga över 8.

Därför är Stuarts ureabuljong selektiv för Proteus-arter, vilket ger positiva resultat inom 24 till 48 timmar efter inkubation, och det är inte effektivt för bakterier som producerar låga mängder ureas eller som långsamt hydrolyserar urea.

Detta beror på att Proteus-arter kan använda urea som kvävekälla. Istället behöver andra ureasproducerande bakterier en ytterligare källa.

Pérez et al. (2002) bestämde att Stuarts ureabuljong var lika effektiv som Christensens ureaagar för att bestämma ureas i jäststammar av släkten Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon och Saccharomyces.

Studieförfattarna påstår sig ha uppnått 100% överenskommelse med båda media (Stuart och Christensen) när de inkuberade under 24 och 48 timmar; med undantag för att de stammar som lyckades förvandla media till en stark rosa-fuchsia färg togs som positiva.

Denna förtydligning är nödvändig, eftersom Lodder (1970) uttalade att nästan alla jästar lyckas förvandla Christensen urea agar-fas till blekrosa. Detta beror på det faktum att de kan hydrolysera urea i minimala mängder, och bildningen av aminer genom oxidativ dekarboxylering av aminosyror på ytan. Detta bör inte tolkas som positivt.

Christensens urea agar eller buljong

Christensens ureabuljong eller agar är mindre buffrat och kan upptäcka små mängder ammoniak. Vidare berikas detta medium med peptoner och glukos. Dessa föreningar får andra ureasproducerande mikroorganismer att växa som inte växer i Stuart-buljong.

Likaså ger Christensen urea-test snabbare resultat, särskilt för Proteus, att kunna ge starkt positivt på bara 30 minuter som en minimitid och upp till 6 timmar som en maximal tid.

Resten av de ureasproducerande mikroorganismerna lyckas vända mediets färg något efter 6 timmar, och starkt efter 24, 48, 72 timmar eller mer, och till och med vissa stammar kan ge svaga reaktioner efter 5 eller 6 dagar.

Tolkning av båda medierna (Stuart och Christensen)

Mediet har ursprungligen gul-orange färg och en positiv reaktion kommer att göra mediets färg till rosa-fuchsia. Färgens intensitet är direkt proportionell mot mängden producerad ammoniak.

En negativ reaktion kommer att lämna mediet med originalfärgen med undantag för jäst, som kan bli blekrosa på Christensens ureaagarmedium.

Förberedelse

Stuarts urea buljong

Väg de nödvändiga gram enligt det kommersiella företagets indikationer. Lös upp i helst sterilt destillerat vatten. Använd inte värme för att lösa upp, eftersom urea är känsligt för värme.

Membranfiltrering används för att sterilisera. För detta används ett Millipore-filter med porer med en diameter på 0,45 u. Använd inte en autoklav. När lösningen har filtrerats fördelas den i sterila rör. För att få tillförlitliga resultat bör det överföras mellan 1,5 ml som en minsta mängd och 3 ml som en maximal mängd per rör.

Förvara i kylskåp och varma före användning.

Om filtreringsmetoden inte är tillgänglig bör mediet användas omedelbart för att få tillförlitliga resultat.

Ett annat sätt att förbereda Stuarts urea buljong är enligt följande:

Vissa kommersiella hus säljer basmediet för urea-testet, inklusive urea.

Den av det kommersiella företaget angivna kvantiteten vägs. Det upplöses i destillerat vatten och steriliseras i autoklaven vid 121 ° C under 15 minuter. Det låter vila lite och när mediet är varmt, tillsätt 100 ml av en urealösning framställd vid 20% och steriliseras genom filtrering.

Det distribueras i sterila rör, som tidigare beskrivits.

Christensens urea agar eller buljong

-Förberedelse av urealösningen

Väg ut 29 g dehydratiserad urea och upplöst i 100 ml destillerat vatten. Använd filtreringsmetoden för att sterilisera. Autoklavera inte.

-Urea bas agar

Lös upp 24 g av den dehydratiserade basagaren i 950 ml destillerat vatten. Sterilisera i autoklaven vid 121 ° C i 15 minuter. Låt den vila tills den når en temperatur på 50 ° C och tillsätt det tidigare beredda ureaet aseptiskt.

Häll 4-5 ml i sterila rör och luta tills det är fast. Det borde finnas en lång flöjt näbb.

Detta medium kan också framställas i flytande form.

tillämpningar

Ureatestet är extremt effektivt för att särskilja släktet Proteus från andra släkter i Family Enterobacteriaceae, med tanke på den snabba reaktionen som ges av Proteus.

Med hjälp av Christensen-kompositionen hjälper testet att skilja mellan arter av samma släkt. Till exempel är S. haemolyticus och S. warneri koagulas-negativa och beta-hemolytiska Staphylococcus, men skiljer sig åt att S. haemolyticus är urea-negativ och S. warneri är urea-positiv.

Å andra sidan använde McNulty framgångsrikt Christensens 2% ureabuljong för att studera närvaron av Helicobacter pylori i biopsiprover tagna från magslemhinnan (antral region).

Närvaron av H. pylori framgår av ett positivt urea-test. Varaktigheten för att observera resultaten är direkt proportionell mot mängden närvarande mikroorganismer.

Som framgår är det en enkel metod för diagnos av Helicobacter pylori i gastriska biopsier.

Slutligen är detta test också användbart för att särskilja arter från släktena Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus och Mycobacteria.

Såning av ureatest

Båda metoderna kräver ett starkt mikrobiellt inokulum för att optimera resultaten. Bakteriekolonier tas företrädesvis från blodagar och jäst från Sabouraud-agar, med några få undantag. Inokulatet emulgeras i det flytande mediet.

För Stuarts ureabuljong, inkubera vid 37 ºC i 24 till 48 timmar, veta att du bara letar efter Proteus-stammar när stammen är en bakterie. För jäst kan den inkuberas vid 37 ° C eller vid rumstemperatur under 24 till 48 timmars inkubation.

När det gäller Christensens ureabuljong, inkuberas den vid 37 ° C i 24 timmar. Om testet är negativt kan det inkuberas i upp till 6 dagar. Om testet är positivt före 6 timmar indikerar det att det är en stam av släktet Proteus.

När det gäller Christensens ureaagar inokuleras agarfaset starkt utan punktering. Buljongen inkuberas och tolkas på samma sätt.

QA

Kontrollstammar såsom Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 och Salmonella typhimurium kan användas för att testa mediet. De två första bör ge positiva resultat och de två senaste negativa resultaten.

Källa: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.

referenser

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Användning av Stuarts ureabuljong för ureastest, som test vid diagnostisering av jäst. Pastor Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Finns på: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemiska tester för identifiering av bakterier av klinisk betydelse. 3: e upplagan Redaktionell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnos. 12 utg. Redaktör Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnos. 5: e upplagan Redaktör Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (Urea agar base) 2015. Tillgänglig på: britanialab.com