PROTEINAS K: EGENSKAPER, ENZYMATISK AKTIVITET, TILLÄMPNINGAR - BIOLOGI - 2025

Den K proteinas är ett enzym som hör till gruppen av serinproteaser, dvs den har i sin mitt ett katalytiskt aktiv aminosyra serin och har funktionen att bryta peptidbindningarna genom hydrolys. I sin tur tillhör detta enzym familjen av subtilisinproteiner (peptidas S8).

Proteinas K har en molekylvikt (MW) på 28 900 dalton och isolerades för första gången 1974 i extrakt av svampen Engyodontium-albumet, tidigare känt som Tritirachium album Limber.

Molekylstruktur av protein K. Källa: Lykchiniadis

Den har en hög proteolytisk kapacitet, visat genom att kunna bryta ner det keratin som finns i håret. Ordet keratin på engelska skrivs "keratin", därför har det kallats "proteinas K".

På grund av sin höga kraft att klyva naturliga proteiner är detta enzym användbart i olika molekylärbiologiska tekniker. Det används främst för att isolera och framställa nukleinsyror med hög molekylvikt (MW).

Proteinas K fungerar genom att frigöra kärn-DNA, medan det förstör proteiner och inaktiverar RNaser och DNaser, det vill säga, det eliminerar nukleaser i DNA- och RNA-beredningar.

Å andra sidan har man sett att proteinas K kan hydrolysera vissa denaturerade nativa proteiner, vilket har väckt forskarnas intresse för dess användning i studien av prionproteiner (PrPC).

Trots deras höga proteolytiska styrka finns det emellertid proteiner som är resistenta mot proteinas K-verkan. Bland dem finns några onormala proteiner som kallas prioner (PrPSc), associerade med överförbara spongiforma encefalopatier.

Proteinas K-egenskaper

Proteinas K har en tertiär struktur som består av tre skikt, med ett sju-kedjigt ß-ark placerat mellan två skikt av spiraler. Eftersom den tillhör S8-familjen av peptidaser, kännetecknas den av att ha en katalytisk triad på sin aktiva plats, vars sekvensordning är (Asp, His och Ser), som skiljer dem från andra familjer av peptidaser.

Detta enzym från gruppen serinproteas kännetecknas av att hydrolysera peptidbindningarna nära den karboxyliska gruppen av alifatiska och aromatiska aminosyror.

Å andra sidan kan den verka i närvaro av vissa frätande ämnen, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL och EDTA, som används för att hjälpa denaturering av proteiner, vilket får dem att förlora sin ursprungliga struktur.

Detta är ett preliminärt steg i beredningen av proteiner för elektrofores-tekniken. PH-intervallet vid vilket proteinas K verkar är ganska brett (2,0 till 12,0), med ett optimalt pH mellan 7,5 och 12,0, och dess isoelektriska punkt är 8,9. Som framgår är det aktivt mot ett mycket brett pH-intervall.

En annan egenskap som sticker ut i proteinas K är dess stabilitet i närvaro av höga temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinas K kräver närvaron av kalciumjon, även om detta inte påverkar dess aktivitet, om det är nödvändigt för att upprätthålla dess stabilitet.

För att proteinas K ska fullständigt smälta substratet är en kontakttid på cirka 5 minuter till 2 timmar nödvändig.

I detta avseende jämförde Daza m.fl. emellertid renheten hos DNA som erhölls vid olika tidpunkter för exponering mot proteinas K och drog slutsatsen att en långvarig inkubation (upp till 24 timmar) förbättrar DNA-kvaliteten avsevärt.

I förhållande till koncentrationen av proteinas K-enzymet som används i de olika protokollen kan det dock sägas att det är mycket varierat.

Det kan användas från mycket låga koncentrationer (5 ug / ml) till koncentrationer på 500 ug / ml. Men de vanligaste arbetskoncentrationerna sträcker sig från 50–100μg / ml, speciellt för proteinspjälkning och nukleasinaktivering. Även för behandling av vävnader krävs en koncentration av 2 mg / ml.

tillämpningar

Dess tillämpningar är mycket breda och kan sammanfattas enligt följande:

-Det används i matsmältningen av proteiner och DNA-extraktion med olika metoder såsom: saltning, PK-SDS, cetyl-trimetylammoniumbromid (CTAB), modifierad kaliumacetat och extraktion med natriumjodid.

-Inaktivering av nukleaser (RNaser och DNaser).

-I hybridiseringstekniken in situ (HIS), för att underlätta frisättningen av nukleinsyra, förutom att eliminera oönskade proteiner.

-Modifiering av proteiner.

-På forskningsnivå i olika studier.

Fördelar med proteinas K

Flera jämförande studier har genomförts mellan DNA-extraktionstekniker som använder Proteinas K, med andra som inte använder det och alla drar slutsatsen att det finns större fördelar med användning av enzymet. Fördelarna inkluderar följande:

-DNA med hög molekylvikt, av hög kvalitet och renhet erhålls.

-Det extraherade DNA är stabilt i upp till 3 månader.

Det extraherade DNA kan användas i följande tekniker: Southern blot, polymeraskedjereaktion (PCR), elektrofores, bland andra.

Proteinas-resistenta proteiner

Olika undersökningar har kommit fram till att prioner (onormala toxiska PrPSc-proteiner) skiljer sig från PrPC (nativa) proteiner genom att vara resistenta mot verkan av proteinas K, medan PrPC: er är känsliga för dess verkan.

Andra författare har beskrivit att det i strukturen för PrPSc finns känsliga delar och andra som är resistenta mot proteinas K. Men båda delarna är lika toxiska och smittsamma.

Å andra sidan isolerade Bastian et al. 1987 1987 4 proteiner av 28, 30, 66 och 76 kda från en art av Spiroplasma mirum. Alla visade sig vara resistenta mot verkan av proteinas K och hade också en korsreaktion med vissa prioner.

Det är känt att denna art kan orsaka grå starr och betydande neurologiska skador och på grund av Bastians vetenskapliga fynd, bland andra undersökningar, har ett försök gjorts att koppla denna mikroorganism till överförbara spongiforma encefalopatier.

Emellertid fortsätter etiologin för denna degenerativa neurologiska patologi att tillskrivas prioner idag.

I detta avseende identifierade och karakteriserade Butler et al. 1991 en klass av proteinresistent mot proteinas K på 40 kda från två stammar av Mycoplasma hyorhinis. Denna patogen påverkar grisar och infekterar deras vävnader, men i detta fall var det ingen korsreaktion med de testade prionerna.

Mer forskning krävs för att belysa många okända i detta avseende.

referenser

1. Bastian F, Jennings R och Gardner W. 1987. Antiserum mot scrapieassocierat fibrilprotein korsreagerar med Spiroplasma miru m fibrilproteiner. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Utvärdering av en DNA-extraktions- och reningsmetod från formaldehyd-fixerad muskelvävnad av oidentifierade kadavrar. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, och Mcgarrity G. Identifiering och karaktärisering av K-resistenta proteiner i proteiner i medlemmar av klassmollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Jämförelse av två Trypanosoma cruzi DNA-extraktionsprotokoll odlade i axeniskt medium. Pastor Peru. Med. Exp. Folkhälsa 2014; 31 (2): 222-227. Finns på: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E och Palma W. Bestämning av effektiviteten hos fem DNA-extraktionsprotokoll från paraffiniserat material för molekylära studier. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.